Epiregulin、Epigen和SCF对山羊精原干细胞体外增殖调控的研究

发布时间：2020-04-24 12:08

【摘要】：精原干细胞(SSCs)是一种位于雄性动物曲细精管基底膜上的成体干细胞,作为一种具有自我更新能力及分化潜能的一种生殖细胞,是精子发生起始过程中的重要组成部分。目前SSCs的体外培养和移植对于研究雄性生殖功能的恢复、转基因动物生产以及雄性生殖细胞分化机理研究有着重要的意义。虽然目前SSCs小鼠的体外培养体系已经较为成熟,参与SSCs自我更新调控的许多分子的功能已被确定,然而仍然有许多能够影响SSCs的细胞因子尚未被发现。因此,进一步研究可能影响SSCs增殖、分化的细胞因子,发现其对体外培养SSCs的具体影响,能够探索完善相关细胞因子的功能,发现新的SSCs调控因子,同时能够为其他哺乳动物SSCs的长期体外培养体系提供借鉴。上皮调节蛋白(Epiregulin)是表皮生长因子家族的成员之一,能够通过表皮生长因子受体(EGFR)的配体调控正常细胞增殖以及抑制肿瘤上皮细胞的增殖。上皮有丝分裂原(Epigen)存在于睾丸、心脏和肝脏中,作为ErbB受体的配体能够促进细胞的有丝分裂。干细胞因子(SCF)其作为一种多功能细胞因子,能够结合其配体C-Kit通过激活相关信号调节多种细胞的生存、增殖以及分化。SCF广泛存在于祖细胞、造血干细胞以及生殖细胞等组织中,研究表明SCF在生殖干细胞的生长调控过程中具有十分重要的生理功能。本研究通过探究在含有GDNF、bFGF、LIF的SSCs培养基中添加Epiregulin、Epigen和SCF对山羊精原干细胞增殖的影响,研究Epiregulin、Epigen和SCF在体外培养过程中对山羊SSCs增殖、细胞池维持以及分化的关键基因以及其增殖通路的关键蛋白的影响,为其他SSCs培养以及研究提供相关的理论参考。本研究获得的主要结果如下:1.通过两步酶消化法和差速贴壁对其SSCs进行提取和富集。富集后的精原干细胞其SSCs相关标记基因显著高于贴壁的支持细胞,对富集后SSCs进行荧光染色鉴定,结果显示纯化后的SSCs其CD9和GFRa1呈阳性。2.在基础培养基中添加20 ng/mL Epiregulin、100 ng/mL Epigen和20 ng/mL SCF可以显著促进山羊精原干细胞的增殖(P0.05),其中添加20 ng/mL Epiregulin和100 ng/mL Epigen的效果显著高于其他组(P0.05),但两组间无显著差异(P0.05)。添加20 ng/ml SCF培养基显著低于上述两组(P0.05)但显著高于对照组(P0.05)。添加Epiregulin、Epigen和SCF均能够提高SSCs的细胞活力,其中添加20 ng/mL Epiregulin具有最佳的提高效果(P0.05),其细胞活力达到1.4±0.08。3.在基础培养基中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL Epiregulin能够显著上调SSCs增殖关键基因LHX 1、C-RET、ETV5和GFRA1的表达(P0.05)而添加20 ng/ml SCF和Epigen与对照组差异不显著(P0.05)。而添加20 ng/mL Epiregulin和SCF能够上调SSCs分化相关基因STRA8和C-KIT,其中添加20 ng/mL SCF的效果显著高于20 ng/mL Epiregulin(P0.05)。同时各组之间的OCT4和PLZF的表达并无显著差异(P0.05)。培养基中添加100 ng/mL Epigen、20 ng/mL Epiregulin和20 ng/mL SCF能够提高SSCs的AKT和p-AKT蛋白表达。在基础培养基中添加Epiregulin、Epigen以及SCF能够促进SSCs的增殖,其中添加100 ng/mL Epigen和20 ng/mL的Epiregulin能够显著促进SSCs的增殖,显著上调SSCs部分增殖关键基因和AKT蛋白的表达。
【图文】：

功能图,精原干细胞,微环境,功能

后的研究表明，利用不同的处理和培养条件成功地将幼年小鼠和成年小鼠的 SS为 ES-LC，而进一步证实 SSCs 可以在某些培养条件下转化为多能细胞（Guan et a；Seandel et al. 2007；Izadyar et al. 2008），然而由于当时对于 SSCs 不同群的纯化和尚不透彻，导致其转换成多能细胞的确切机制的研究并不完善，其很可能涉及的表ct4、sox2、c-Myc 以及 KLF4 等核心转录因子对 IPSS 的诱导（Takahashi et al. 2003）。

激酶,途径,转录因子,信令

Src 家族激酶从而介导 PI3 激酶/Akt 途径而起到调节作用。.5.1.2 成纤维细胞生长因子 2(FGF2/bFGF)FGF2 是 SSCs 细胞培养中另一不可或缺的外在因子。GDNF 和 FGF2 均能够激活AP2K1，但 FGF2 具有更强的结合能力（Kanatsu-Shinoharaetal 2013；Mei et al. 2015）。时研究发现 MAP2K1 的磷酸化可替代 FGF2 的添加，从而证实 FGF2 通过 MAP2K径促进增殖。其中三种转录因子（Bcl6b、Etv5 和 Lhx1）在 FGF2 途径的下游起作用，为它们在 MAP2K1 失活后下调（Takashima et al. 2015）。然而，在先前的研究中，这个转录因子能够通过 SFK 信令作用 GDNF 的下游，这表明 GDNF 和 FGF2 信令可能部分冗余的（Mei et al. 2015）。另外，他们发现 FGF2 的下游 MEK（促分裂原活化蛋激酶/ ERK1 激酶），其激活是细胞周期进程的关键信号。在添加 MEK 抑制剂的情况，其能够显著抑制 GS 细胞增殖，而具有活化 MEK 的 GS 细胞仅用 GDNF 便能够在外表达出高增殖能力，表明 FGF2 可能是通过 MEK 的激活上调起到与 GDNF 协同促 SSCs 自我更新的作用（Guo et al. 2017）。总体而言，，Kanatsu-Shinohara 等（2013）认 FGF2 可以通过通过复杂的多种信号途径与 GDNF 协同促进 SSC 自我更新和增殖。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827

【参考文献】