转录调节因子GreA对土拉弗朗西斯菌环境适应性和致病性的影响

发布时间：2020-04-26 00:35

【摘要】：土拉弗朗西斯菌是一种细胞内寄生的革兰氏阴性短杆菌,可以通过呼吸道、消化道、伤口和昆虫叮咬等多种途径感染人类和多种动物引起土拉热。由于土拉弗朗西斯菌对人具有很强的致病性,近年来,国内外学者针对细菌的致病机制开展了大量的研究工作。我们前期毒力因子筛选研究发现土拉弗朗西斯菌greA基因突变株在感染小鼠体内的存活能力显著下降,预示该基因的表达及其产物影响了细菌感染和致病作用。已有的研究表明,细菌greA基因编码转录延长因子GreA,其诱导的RNA聚合酶(RNAP)核酸切割活性在RNA延伸过程中可以降解停顿在复制通道中的RNA末端使其处于活性中心正确位置,进而抑制转录延长复合物转录暂停、促进RNAP从启动子逃逸及增强基因转录保真性等。为探讨GreA蛋白对土拉弗朗西斯菌感染及致病力的影响,本研究以土拉弗朗西斯菌新杀手亚种U112为模式菌株,利用同源重组构建了 greA基因缺失株及反式回补株,体外培养检测表明:1)greA基因缺失对土拉弗朗西斯菌的菌体形态、温度敏感性和pH敏感性无显著影响,但greA缺失细菌繁殖的代次时间延长、对高浓度NaCl的抵抗力下降,然而,细菌的生物膜形成能力显著增强,表明GreA影响土拉弗朗西斯菌的环境适应性;2)细胞感染实验表明,土拉弗朗西斯菌greA基因缺失突变株对细胞的入侵及胞内增殖显著降低。小鼠感染实验发现,土拉弗朗西斯菌greA缺失株经皮下或呼吸道感染小鼠的致病力显著下降,缺失突变株在小鼠的肝脏、脾脏和肺脏中繁殖能力亦显著低于亲代,并且被快速清除,进一步证明GreA影响土拉弗朗西斯菌的致病力。为进一步探讨GreA影响土拉弗朗西斯菌生理功能与致病力的分子机制,本研究利用转录组学(RNA-seq)技术比较分析了 greA基因缺失突变株和亲代毒株基因转录和表达的差异。RNA-Seq分析结果表明,greA基因缺失对土拉弗朗西斯菌新杀手亚种的196个基因表达产生显著的影响(相差2倍以上),这些基因除了影响细菌氨基酸、碳水化合物及无机离子代谢外,其中77个差异表达基因与土拉弗朗西斯菌的致病力相关,包括所有毒力岛基因。利用β-半乳糖苷酶实验证实pdpD、pepO、FTN_1104的启动子活性可以被GreA调节,表明GreA可以通过启动子调控基因转录。为验证GreA对毒力基因表达调控的影响,本研究构建了 FTN_1104、ampD和pepO等与细胞入侵相关的下调基因的缺失突变株,并通过细胞感染实验证明FTN_1104和ampD缺失影响土拉弗朗西斯菌的细胞入侵。综上,土拉弗朗西斯菌GreA蛋白可以通过调控基因启动子等途径影响细菌基因转录,进而调节细菌的环境适应性、细菌对细胞的侵染和对宿主动物的致病力。细菌GreA蛋白的保守性及其对细菌致病力的影响,也为进一步开展土拉弗朗西斯菌的预防治疗提供了一种新的药物靶标。
【图文】：

荚膜位于细菌的最外层，根据菌株的不同，主要由多糖或多肽组成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亚种与全北极亚种菌体外层均含有荚膜样物质，它们的主要成分为脂质、糖蛋白与多糖复合逡逑物［２８１（图１－２）。先前的研究一般认为新杀手亚种不形成荚膜，但最新研究显示，新杀手亚种菌株逡逑在适当条件下培养后，可以形成类似于土拉亚种的荚膜样物质，并且这些荚膜样物质的糖基化有逡逑助于细菌的致病力与免疫保护｜２７］。荚膜缺失菌株对血清补体更加敏感，对小鼠的致病力也随之下逡逑降［？３２］。苏敬良等发现土拉弗朗西斯菌中含有炭疽杆菌聚Ｙ谷氨酸荚膜生物合成的同源基因操纵逡逑子，并将其命名为缺失这些基因后可以导致细菌的细胞内适应性下降、对小鼠的致病逡逑力下降［３３］。但相关研究发现，ＣａｐＡＢＣ并不参与荚膜的合成［３２１。土拉亚种与全北极亚种荚膜多糖逡逑与ＬＰＳ的Ｏ抗原结构基本相同，因此可以将其归类为Ｏ抗原荚膜［气进一步研究发现，破坏ＬＰＳ逡逑的０抗原生物合成有关的部分糖基转移酶基因（ｗ汾／，逦ｗ＆Ｍ邋ｗ＆Ｃ）会导致荚膜的逡逑丢失１３２），表明土拉弗朗西斯菌的０抗原荚膜与其ＬＰＳ的０抗原生物合成及组

４－２０邋ｈｒｓ逦Ｚ逡逑ｐｏｓｔ－ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑图１－１邋土拉弗朗西斯菌对巨噬细胞的感染逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ．邋ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ邋ｉｎ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ１＇８１逡逑通过生物信息学分析发现，土拉弗朗西斯菌中不存在其它胞内寄生菌中普遍存在的毒素基因逡逑与分泌系统，同时，它也缺乏其它胞内寄生菌吞噬泡逃逸的同源基因。因此，土拉弗朗西斯菌中逡逑必然存在独有的细胞入侵及吞噬泡逃逸机制，辅助其完成细胞感染。目前已知的与土拉弗朗西斯逡逑菌细胞感染相关的毒力因子主要包括荚膜、脂多糖（ＬＰＳ）、ＶＩ型菌毛系统、几种分泌系统、夕卜逡逑膜蛋白、毒力岛以及部分代谢基因等ｐ７］。逡逑１．３．１荚膜逡逑荚膜位于细菌的最外层，根据菌株的不同，主要由多糖或多肽组成。在土拉弗朗西斯菌中，逡逑土拉亚种与全北极亚种菌体外层均含有荚膜样物质，它们的主要成分为脂质、糖蛋白与多糖复合逡逑物［２８１（图１－２）。先前的研究一般认为新杀手亚种不形成荚膜，，但最新研究显示，新杀手亚种菌株逡逑在适当条件下培养后，可以形成类似于土拉亚种的荚膜样物质，并且这些荚膜样物质的糖基化有逡逑助于细菌的致病力与免疫保护｜２７］。荚膜缺失菌株对血清补体更加敏感
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

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本文编号：2640877