猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性的初步研究

发布时间：2020-04-27 06:25

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种严重危害养猪业的高度传染性、出血性疾病(Liess et al.1987)。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。基于其很好的免疫原性,且能诱导机体产生高水平的病毒中和抗体,E2蛋白是CSF亚单位疫苗及相关检测技术开发理想的候选抗原。毕赤酵母表达体系具有分泌表达、真核修饰等优点,是E2蛋白理想的表达系统。本研究以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转化获得毕赤酵母X-33菌阳性克隆,经SDS-PAGE、western-blot鉴定筛选出E2蛋白表达菌株。通过探究诱导培养基pH、诱导剂浓度以及诱导时间使E2蛋白在摇瓶达到最佳表达量。将培养基上清进行Ni NTA亲和层析、离子交换等纯化方法获得较纯E2蛋白,对其糖基化修饰、二聚体结构进行分析;并将纯化的蛋白免疫动物,根据血清学试验分析蛋白免疫原性。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌表达,且表达的E2蛋白为二聚体结构,具有糖基化修饰。血清学分析表明该蛋白具有良好的免疫原性。本研究为猪瘟病毒亚单位疫苗、单克隆抗体筛选及相关检测技术的开发奠定了基础。总体实施方案主要分为以下几个部分:1.pPICZαA-E2载体构建参照NCBI数据库中猪瘟病毒兔化弱毒疫苗E2蛋白的氨基酸序列(GenBank:AF531433),截取E2(345 aa)序列胞外区基因,将E2序列克隆至pPICZαA载体。PCR鉴定及质粒测序表明重组载体构建成功。2.电转化与酵母单克隆筛选提取质粒pPICZαA-E2,经PmeI酶切线性化后回收,经紫外分光光度计测定质量为6.14μg,可用于电转。电转结束至酵母单克隆形成后,无菌挑取菌落至5 mL YPD液体培养基中30°C、220 rpm振荡培养24 h,进行菌液PCR鉴定,结果表明挑取的克隆PCR均为阳性。3.CS FV E2蛋白的表达及纯化将PCR鉴定阳性菌液进行诱导表达,取第3 d培养基上清1 mL,用Ni NTA填料4°C过夜富集,western-blot鉴定结果表明重组E2蛋白表达成功。分别设置不同pH诱导培养基,不同诱导时间,不同诱导剂浓度,在诱导时间为5 d、诱导剂浓度为0.5%、培养基pH为3或4时蛋白表达量最高;确定蛋白纯化中洗杂液、洗脱液的浓度,确定了最佳纯化方法。4.E2蛋白活性分析采用斑点杂交(dot-blot)试验检测E2蛋白活性,dot-blot试验方法改进自Sithigorngu(1991)。取干燥硝酸纤维素膜(NC膜),将样品1μL量点样于膜上,60°C烘干,浸入0.25%戊二醛30 min,用ddw(双蒸水,double distilled water)洗三遍后将膜浸泡在含5%脱脂奶的PBST中室温封闭2 h。分别孵育一抗与相应的二抗,显色并观察。结果表明猪瘟阳性猪血清能很好的识别E2蛋白。5.蛋白结构鉴定取纯化好的E2蛋白10μg用肽N-糖苷酶F(PNGase-F)处理,于12%SDS-PAGE跑胶并转膜,分析去糖基化程度。将纯化的蛋白进行非还原(non-ruducing)处理,通过western blot分析蛋白二聚体结构。结果表明E2蛋白具有糖基化修饰,以二聚体形式存在。6.免疫学活性分析将纯化的E2蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混合并乳化,作为一免用免疫原。E2蛋白与弗氏不完全佐剂按1:1乳化,作为二免用免疫原。分别免疫兔子与小鼠,每7 d采血并制备血清,-20°C冻存用于血清学分析。兔血清猪瘟抗体阻断率为92.5%,小鼠血清猪瘟抗体阻断率为58.0%,IPMA试验结果表明小鼠血清能与猪瘟病毒反应。本研究的意义在于成功建立CSFV重组E2蛋白X-33毕赤酵母表达体系,获得了高纯度E2蛋白,对其糖基化修饰与结构进行分析鉴定,并对其免疫效果进行评价分析。这些研究结果表明毕赤酵母表达的CSFV重组E2蛋白免疫原性良好。为猪瘟新型亚单位疫苗的研究、单克隆抗体的筛选及猪瘟检测技术的开发提供了一定的基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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