GRα调控Tβ10致猪骨骼肌细胞氧化应激的研究

发布时间：2020-04-26 21:47

【摘要】：应激反应导致机体内应激激素大量分泌,其中以皮质醇为主,它是影响肉质的一个较为重要的因素。课题组前期研究表明,在动物日粮饲喂过程中添加皮质醇会导致仔猪背最长肌肌肉组织受损严重,肌纤维间隙增大,凋亡细胞数增多。但目前关于应激激素是如何影响肉质以及通过何种方式导致肉质发生变化的机制并不完全清楚。现今研究表明糖皮质激素(glucocorticoid,GC)主要通过细胞膜与体内糖皮质激素受体α(glucocorticoid receptor alpha,GRα)结合发挥一系列调控作用。在这些基础上,本课题以GRα为主要研究对象,探究GRα对猪原代骨骼肌细胞(pig skeletal muscle cells,PSC)生长的影响以及在猪劣质肉产生过程中的作用,并探究相关分子调控机制。本课题主要研究结果如下:1.地塞米松引起猪肌细胞氧化应激地塞米松(dexamethasone,DEX)处理PSC细胞后发现其对肌细胞有明显的毒性,且与对照组相比DEX组细胞内的活性氧自由基大量上升,造成细胞氧化应激;等浓度米非司酮(mifepristone,RU486)处理后细胞内的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)明显下降。通过MTT法检测DEX对PSC细胞增殖的影响,实验结果表明:DEX抑制PSC细胞增殖。通过qPCR和Western blot检测DEX对细胞应激的影响,结果表明:DEX能促进PSC细胞中HSP90的表达;等浓度RU486处理后能抑制PSC细胞中HSP90的表达。2.GRα对PSC细胞功能的影响通过构建GRα超表达载体和合成siRNA来超表达和抑制GRα的表达。通过流式细胞仪和MTT法检测GRα对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达GRα可以促进PSC细胞凋亡,抑制PSC细胞增殖。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR检测GRα对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达GRα能促进PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和GPX2的表达;同样,干扰GRα能抑制HSP90、CAST和GPX2的表达。超表达GRα和干扰GRα后检测谷胱甘肽过氧化物酶活性,实验结果表明:超表达GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高,干扰GRα后谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。可能是机体应激水平过高,并通过提高谷胱甘肽过氧化物酶活性以维持机体稳定。3.GRα靶基因的筛选干扰GRα后根据表达差异筛选GRα的靶基因,定量结果显示,干扰GRα后极显著下调Tβ10的表达,下调HSP90和HSP27的表达;且超表达GRα后Tβ10的表达显著升高,上调HSP90和HSP27的表达,且在网站上预测出GRα与Tβ10的结合位点。因此推测Tβ10可能是GRα的靶基因,双荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等试验初步验证,结果表明Tβ10可能是GRα潜在的靶基因。构建Tβ10超表达载体后通过流式细胞仪检测Tβ10对PSC细胞凋亡的影响,结果表明:超表达Tβ10可以促进PSC细胞凋亡。且通过检测细胞的氧自由基发现其含量显著升高,说明细胞处于氧化应激状态。通过qPCR实验检测Tβ10对细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果表明:超表达Tβ10能促进PSC细胞中BAX、HSP90、HSP27和CAST的表达。4.APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激与GRα组相比添加不同浓度的(0.1 mg/mL,1 mg/mL,10 mg/mL和100 mg/mL)黄芪多糖(astragalus Polysacharin,APS)后可缓解细胞应激,并通过检测ROS含量找出最适浓度为10 mg/mL。添加10 mg/mL APS后机体的ROS水平显著降低,且与对照组趋于一致。通过MTT法检测APS对PSC细胞增殖的影响,结果表明:APS可显著缓解超表达GRα后抑制PSC细胞增殖的作用。且添加APS后与GRα组相比谷胱甘肽过氧化物酶活显著降低,从而维持机体稳定。通过QPCR和Western blot检测APS对PSC细胞应激与凋亡调控相关基因的影响,结果显示:与GRα组相比添加APS可抑制PSC细胞中BAX、HSP90、CAST和Tβ10的表达。表明APS通过抑制GRα的表达缓解机体应激。
【图文】：

信号传导

GRα 调控 Tβ10 致猪骨骼肌细胞氧化应激的研究有细胞都是它的靶细胞。如图 1-1 所示，糖皮质激素穿过细胞SP90 复合物结合。在配体结合后，HSP90 被释放，并且 GR 转移至细核中它可以结合 DNA 并与共激活剂(CoA)和转录起始结构相互作用以。GR 还可以通过与 DNA 结合或通过蛋白质-蛋白质相互作用抑制基因GR 也可以通过激活激酶途径与细胞膜结合快速引起信号传导(Garabed。

氧化应激,糖皮质激素,细胞凋亡

皮质激素通过细胞凋亡影响肉质图 1-2 所示，细胞凋亡是一个复杂的过程不仅受外部信号控制，而且序的调控，研究表明 EADs 诱导机体氧化应激且凋亡因子表达水平发致细胞凋亡(Yin et al 2015)。研究表明糖皮质激素以组织特异性方式控存活，且糖皮质激素可诱导单核细胞，巨噬细胞和 T 淋巴细胞发rdam et al 2002)。较多文献报道糖皮质激素是通过调节一些基因包括和NF-κB来发挥细胞凋亡作用的(Lotem et al 1995, Pecci et al 1997, H)。应激导致皮质醇升高将活化的 GRα 移位进入核中，与 IP3R1 基因调 IP3R1 的表达引起细胞凋亡，受损的肌细胞导致了肉质的变化(C因此机体应激导致体内糖皮质激素水平的变化，，从而上调或下调一些起肉质损伤。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828

【参考文献】