抗旋毛虫天然植物提取物筛选和作用机理初步研究

发布时间：2020-04-26 21:08

【摘要】：旋毛虫病是一种由旋毛形线虫引起的人兽共患寄生虫病,同时也是一种广泛流行的食源性寄生虫病,人感染旋毛虫的主要原因是生食或半生食含有旋毛虫包囊的肉制品,感染旋毛虫后会表现出全身发热、腹痛、腹泻、眼睑水肿、心肌炎、全身肌肉疼痛等症状,重症患者甚至可因并发症而死亡,对人体健康产生极大危害。当前临床上应用最普遍的治疗药物是阿苯达唑和苯并咪唑,但副作用明显,因此开发旋毛虫新型药物仍是研究热点。植物源物质来源于自然,具有安全、低毒、对非靶标生物毒害较低、对环境无污染等优点,从天然植物中获取有效物质并用于病虫害防治是目前国际上的一种趋势。本研究在体外培养条件下,用具有药理作用的20种天然植物提取物与旋毛虫共培养,筛选出能够对旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫三个发育阶段的虫体具有杀伤作用的植物提取物,进而通过体内外试验研究筛选提取物对旋毛虫体内三个发育阶段虫体的杀伤效果并初步探索其杀伤机理,以期为防治旋毛虫病提供新的治疗药物和新途径。主要研究内容及结果如下:(1)对旋毛虫各发育期虫体具有杀伤作用的天然植物提取物体外筛选:分别收集旋毛虫成虫、新生幼虫、肌幼虫进行体外培养,设空白对照组、DMSO组以及浓度分别为10、50、100mg/L的天然植物提取物组,置于37 5%CO℃2培养箱中24h,镜检并计算虫体死亡率,统计分析结果表明血根碱(50mg/L)和蔓生白薇苷G(50、100mg/L)对旋毛虫肌幼虫有杀伤作用,作用24h后死亡率分别达到100±0.0%、87.3±4.9%、100±0.0%。血根碱、补骨脂素、扁桃苷、金丝桃苷对旋毛虫成虫有杀伤作用,其中血根碱、补骨脂素、扁桃苷浓度在10mg/L时作用24h后死亡率分别达到71.6±5.3%、97.4±6.5%、93.8±5.1%,在50mg/L时死亡率均达到100±0.0%;金丝桃苷浓度在50mg/L时作用24h后死亡率为87.6±5.8%,在100mg/L时死亡率达到100±0.0%。血根碱、桑根酮C对旋毛虫新生幼虫均有杀伤作用,其中10mg/L血根碱作用24h后死亡率达到100±0.0%;桑根酮C浓度在50mg/L和100mg/L时作用24h后虫体死亡率分别为98.3±5.9%和100±0.0%。(2)血根碱对旋毛虫各发育期虫体杀伤效果和杀虫机理研究:用血根碱作用于体外培养的旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫,结果可见血根碱在浓度14-30mg/L之间对旋毛虫肌幼虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度30mg/L时虫体死亡率达到100%;在浓度3-15mg/L之间对旋毛虫成虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度15mg/L时虫体死亡率达到100%,并且随着血根碱浓度的升高,旋毛虫成虫产生新生幼虫的数量逐渐减少;在浓度1.4-3mg/L之间对旋毛虫新生幼虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度3mg/L时虫体死亡率达到100%。扫描电镜观察血根碱对体外培养旋毛虫成虫体表的损伤,可见血根碱作用后的旋毛虫成虫虫体皱缩,环形皱褶加深,局部表皮溃烂,体表纵嵴消失,结构模糊,雄虫交配附器叶状小片塌陷、萎缩,无法辨认两对乳突、生殖裂口,表明血根碱能够严重侵蚀破坏旋毛虫成虫体表结构。体内实验分为3个时期,每个时期选取8周龄雌性BALBc小鼠60只,随机平均分为6组,设空白对照组、攻虫组、DMSO组、阿苯达唑组,体内旋毛虫成虫期、幼虫移行期、幼虫成囊期分别设浓度为70和80mg/kg、80和100mg/kg、100和150mg/kg的血根碱治疗组,分别于感染旋毛虫后24h内3次、13d及35d连续3天给予血根碱治疗,第7d、30d、46d天处死各组小鼠,收集虫体并计数,计算减虫率。结果表明血根碱对体内旋毛虫成虫期、幼虫移行期、幼虫成囊期均具有较好治疗效果,血根碱浓度在70mg/kg和80mg/kg时对旋毛虫成虫期的减虫率分别为37.2%和36.9%;在80mg/kg和100mg/kg时对旋毛虫幼虫移行期的减虫率分别为26.4%和39.6%;在100mg/kg组和150mg/kg是对旋毛虫幼虫成囊期的减虫率分别为31.7%和42.3%。HE染色观察小鼠十二指肠、舌肌和咬肌病理变化,测量肠绒毛长度和隐窝深度计算肠绒毛-隐窝比值(V/C),可见不同浓度血根碱治疗后的小鼠组织病理均有不同程度的减轻,并且血根碱可以恢复肠绒毛长度,V/C显著升高(P0.05)。PAS染色观察十二指肠计数肠粘膜杯状细胞数量,结果显示血根碱能使肠粘膜杯状细胞显著增多(P0.05),增强黏膜免疫促进虫体排出。ELISA法检测小鼠血清中活性氧簇(ROS)含量,结果表明血根碱能在旋毛虫幼虫移行期升高ROS含量,维持体内ROS平衡。本研究筛选到血根碱、蔓生白薇苷G、补骨脂素、扁桃苷、金丝桃苷和桑根酮C对旋毛虫有明显杀伤效果,其中血根碱对体内、体外旋毛虫三个发育时期虫体均有杀伤作用,并且能够减轻肠道和肌肉的病理变化,通过升高ROS含量,维持体内ROS平衡和增加肠粘膜杯状细胞数量促进虫体排出。
【图文】：

形态图,血根碱,旋毛虫肌幼虫,形态

mortality of Trichinella spiralis muscle larvae after sanguinarinedifferent concentrations for 24h空白对照组比较 P<0.05。.1 所示，空白对照组（图 A）的肌幼虫可见虫体头部有活动，，内部很完整，虫体活力良好。血根碱浓度 30mg/L 组（图 B）肌幼虫虫，每条虫体持续观察 30s 均没有活动迹象。MSO 组空白对照组不同血根碱浓度组(mg/L)12 14 16 18 20 22 24 265.3±0.5 4.2±1.73.7±1.116.0±2.0*38.7±3.5*52.3±5.5*54.0±4.6*64.7±6.4*82.0±7.8*89.±2.*A B

形态图,旋毛虫成虫,血根碱,形态

A、15mg/L 组与空白对照组相比差异显著(P<0.05）。表 2-2 旋毛虫成虫与不同浓度血根碱作用 24h 后的死亡率 mortality of Trichinella spiralis adult after sanguinarine treatmconcentrations for 24h空白对照组比较 P<0.05。.2 所示，空白对照组（图 A）旋毛虫成虫虫体活动频率高，虫体，活力良好。血根碱浓度 15mg/L 组（图 B）旋毛虫成虫呈直线僵直不动。DMSO 组空白对照组不同血根碱浓度组(mg/L)1 3 5 7 9 11 5.4±0.8 4.3±1.13.3±1.718.3±2.1*28.3±1.5*47.3±4.9*63.0±5.6*83.3±4.5*B
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S853.7

【参考文献】