犬C-反应蛋白荧光定量免疫层析检测方法的建立与应用

发布时间：2020-04-28 22:14

【摘要】：试验开展了犬C-反应蛋白(C-CRP)荧光微球免疫层析定量方法的研究,旨在研制一种操作简易、灵敏度高,用于快速定量检测C-CRP荧光免疫层析试纸条。采用双抗体夹心法和荧光免疫层析技术,以羧基荧光微球标记的抗C-CRP单克隆抗体及羊抗鸡IgY为标记抗体,抗C-CRP单克隆抗体和鸡IgY分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。结果显示,所制备C-CRP检测试纸条的检测范围为0.5～250mg/L,检测限为0.5mg/L,批内和批间变异系数(CV)分别为0.68%～6.94%和0.89%～8.79%,平均回收率为98.15%～101.19%,试剂与9种干扰物质无交叉反应。加速破坏稳定性试验表明试纸条可以常温放置24个月。临床样本测试发现,其与I-CHROMA试剂盒检测结果相关性良好(R2=0.995)。综上所述,该荧光免疫层析试纸条灵敏度、特异度较高,且操作简单、快速,可用于宠物犬临床检测。
【图文】：

抗体浓度,微球,荧光强度

ＨＲＯＭＡ）试剂盒检测２３３例犬随机血液样本，取２次重复的平均值，比较检测结果相关性。２结果２．１抗体标记浓度对微球荧光强度的影响浓度为０．０１ｍｇ／ｍＬ不同标记量的荧光微球经荧光光谱仪连续扫描，最大激发波长为４６９ｎｍ，最大发射波长为５２７ｎｍ，说明微球在检测时激发光和发射光更容易分开，降低了背景干扰的几率。原荧光微球和偶联抗体浓度为０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｍｇ／Ｌ的免疫荧光微球发射光谱见图１。由图１可知，荧光微球偶联不同浓度的抗体发射光谱的峰型规则，与偶联前有相同的峰位，发射谱峰未见偏移，荧光强度未有明显的降低。表明荧光微球的发射光谱的位置与抗体的标记量无关，偶联过程中微球光学性质基本没有改变。但荧光微球偶联过程中，可能会有损失，造成荧光微球光学强度略微下降，且随着偶联抗体量的增加，荧光微球光学强度也会稍微降低。图１不同抗体浓度标记微球的荧光强度Ｆｉｇ．１Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｏｆｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｌａｂｅｌｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ２．２荧光微球扫描电镜图谱荧光微球的扫描电镜图谱见图２。由图２可知，微球粒度均一，并且偶联抗体后未引起微球的团聚。免疫荧光微球表面有明显的蛋白分子层，呈均匀分散状态，表明抗体标记效果良好。３２６

曲线,免疫荧光,微球,扫描电镜图

中国畜牧兽医４６卷Ａ，原荧光微球；Ｂ，免疫荧光微球Ａ，Ｏｒｉｇｉｎａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；Ｂ，Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ图２免疫荧光微球扫描电镜图谱（１００００×）Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｍａｐｐｉｎｇｏｆｔｈｅｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ（１００００×）２．３Ｃ－ＣＲＰ荧光定量免疫层析试纸条的标准曲线依次测定浓度为０、２．５、６、１５、２０、４８、１００、２５０ｍｇ／Ｌ的标准品Ｔ／Ｃ值，重复１０次，以荧光信号Ｔ／Ｃ值为Ｙ轴，标准品浓度的对数值为Ｘ轴拟合标准曲线，，结果见图３。由图３可知，Ｃ－ＣＲＰ标准方程为：Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７），曲线拟合度较好。２．４检测范围及灵敏度将浓度为０的标准品１０次测定的荧光值均值加２倍标准偏差代入Ｙ＝１．１００８３－０．２４９１６Ｘ＋１．０４５１Ｘ２（Ｒ２＝０．９９９７）中，得到试剂盒检测限为０．５ｍｇ／Ｌ，试剂分析灵敏度较高，试剂检测范围为０．５～２５０ｍｇ／Ｌ。２．５精密度抽取２个批次的Ｃ－ＣＲＰ检测试剂，分别对Ｃ－ＣＲＰ浓度为５、５０、２５０ｍｇ／Ｌ标准品进行检测，结果见表１。由表１可知，批内和批间变异系数分别为０．６８％～６．９４％和０．８９％～８．７９％，批内与批间各检测浓度变异系

【参考文献】