陕北白绒山羊毛囊干细胞增殖分化相关miRNA的鉴定及功能研究

发布时间：2020-04-29 05:42

【摘要】：陕北白绒山羊是我国重要的绒山羊品种,其羊绒具有极大的经济价值。绒毛的周期性生长与毛囊干细胞及其毛乳头细胞相互调控有着密切的联系。本研究初步探究毛乳头细胞来源外泌体对毛囊干细胞增殖分化的影响。首先在体外培养分离陕北白绒山羊毛囊干细胞和毛乳头细胞来源外泌体;通过对毛囊干细胞与毛乳头细胞共培养组和对照组进行精准定量转录组和mi RNA测序分析,以及对毛乳头细胞和毛乳头细胞来源外泌体进行mi RNA测序分析,筛选出与毛囊干细胞增殖分化相关的关键基因及mi RNA;利用双荧光素酶报告系统检测毛乳头细胞来源外泌体的mi R-22-5p和let-7b-5p与预测靶基因的靶向关系,并探究mi R-22-5p和let-7b-5p对毛囊干细胞增殖分化的调控作用。本研究取得主要研究结果如下:1.利用毛囊贴壁法成功分离出陕北白绒山羊毛囊干细胞,结合Ⅳ型胶原快速差异贴壁法和流式细胞分选法得到高纯度的毛囊干细胞。通过显微镜和透射电镜进行形态学观察,发现所收集的细胞具有毛囊干细胞的特征;而且表达CD34,K15和ITGβ1等毛囊干细胞的分子标记;成功建立毛囊干细胞与毛乳头细胞共培养诱导分化为毛囊细胞的体系。2.成功构建陕北白绒山羊毛囊干细胞与毛乳头细胞共培养组和对照组样品的6个m RNA文库和6个Small RNA文库。转录组测序分析发现两组样品中共表达的基因有12802个,差异表达的基因有656个,其中上调基因有342个,下调基因有314个;靶基因GO和KEGG富集分析结果表明,这些差异表达的基因与TNF、p53、Apoptosis等信号通路相关。mi RNA测序分析发现两组样品间差异表达的mi RNA有13个,其中上调mi RNA有6个,下调mi RNA有7个;筛选出4个关键候选mi RNA,分别为mi R-1、mi R-151-3p、mi R-182、mi R-143-3p;靶基因GO和KEGG富集分析结果发现,靶基因与RNA transport、Legionellosis通路相关。m RNA与mi RNA联合分析发现差异基因主要富集在TNF、Fox O和Amphetamine addiction三个通路,与细胞增殖,凋亡和代谢有关。3.利用梯度离心和超速离心,从陕北白绒山羊毛乳头细胞体外培养基中成功分离出细胞外囊泡,通过外泌体标志性蛋白、粒径大小和透射电镜观察等证明,分离得到的细胞外囊泡为外泌体。在体外通过Transwell小室将毛囊干细胞与Di I标记的毛乳头细胞共培养,以及用Di I标记的外泌体孵育毛囊干细胞,证明毛乳头细胞来源外泌体可以运输到毛囊干细胞,且毛囊干细胞能够摄取毛乳头细胞来源外泌体。4.成功构建毛乳头细胞及其外泌体的6个Small RNA文库。测序分析发现271个已知的mi RNA,其中187个mi RNA共表达,79个mi RNA在毛乳头细胞特异表达,5个mi RNA在毛乳头细胞来源外泌体特异表达;在毛乳头细胞和毛乳头细胞来源外泌体差异表达的mi RNA有111个,在毛乳头细胞来源外泌体49个mi RNA上调,62个mi RNA下调;在外泌体上调的49个mi RNA中,mi R-21-5p、mi R-143-3p、let-7i-5p、mi R-148a-3p、let-7b-5p表达量位于前五。同时还发现336个新mi RNA,其中141个mi RNA在毛乳头细胞和毛乳头细胞来源外泌体中差异表达。5.毛乳头细胞和毛乳头细胞来源外泌体差异表达的mi RNA预测得到33055个靶基因;GO富集分析结果表明,靶基因主要富集在细胞组分的胞外区域等功能子集,分子功能的结合和催化活性等功能子集以及生物过程的大分子修饰等功能子集;KEGG生物学通路注释发现,靶基因注释到271个通路中,主要参与了细胞信号转导、胞吞作用、蛋白质表达调节、脂质和脂肪酸代谢。6.成功构建了mi R-22-5p候选靶基因IGF1R,SOX9,MSI2,FOXC1,FOXP1和LEF1的双荧光素酶报告载体;双荧光素酶报告系统检测结果表明,LEF1是mi R-22-5p的靶基因,mi R-22-5p能够靶向调节预测的LEF1的靶位点;在毛囊干细胞中过表达mi R-22-5p发现,mi R-22-5p经由AKT信号通路抑制毛囊干细胞的增殖,但对毛囊干细胞向毛囊细胞分化无显著影响。7.成功构建了let-7b-5p候选靶基因KDM6A,FOXC1和MSI2的双荧光素酶报告载体;双荧光素酶报告系统检测结果表明,FOXC1和MSI2是let-7b-5p的靶基因,let-7b-5p能够靶向调节预测的FOXC1和MSI2的靶位点;在毛囊干细胞中过表达let-7b-5p,发现let-7b-5p经由AKT信号通路抑制毛囊干细胞的增殖,并通过激活Notch信号通路从而促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化。综上所述,本研究成功分离得到陕北白绒山毛囊干细胞及毛乳头细胞来源外泌体。通过对毛囊干细胞与毛乳头细胞共培养组和对照组进行转录组和mi RNA测序,以及毛乳头细胞和毛乳头细胞来源外泌体的mi RNA测序,利用生物学信息分析筛选出影响毛囊干细胞增殖分化的关键基因和mi RNA,并验证毛乳头细胞来源外泌体的mi R-22-5p和let-7b-5p对毛囊干细胞增殖分化的调控作用,为进一步阐明调控毛囊干细胞增殖分化及毛囊周期循环的分子机理奠定基础。
【图文】：

图 1-1 毛囊的解剖结构(Alonso and Fuchs, 2006)Figure 1-1 Anatomy of Hair Folliclehair root）（皮肤以内的毛发部分）由内根鞘（inner root sheath， root sheath，ORS）包围和固定。IRS 由外向内由三层组成：Cuticlee 层(Montagna et al., 1958)。IRS 从毛母质延伸至皮脂腺导管开口S 逐渐消失，只留下毛干的鞘小皮（Cuticle）层和 cortex 层暴露 Cuticle 与毛干的 Cuticle 结构相同，互相借助锯齿状突起紧密连着，决定毛干的形状。ORS 与 IRS 的 Henle 层相邻并深入真皮 IRS，，在 DP 毛球区域处 ORS 逐渐消失。ORS 向外延伸的区域所组成的皮脂腺（sebaceous gland），这些细胞体积很大，细胞泡，并通过皮脂腺导管连接在一起。表皮细胞分为干细胞、短暂增殖细胞（transit amplifying cells，化细胞（postmitotic differentiating cells，PDC）三种。在立毛肌附突”（Bulge）是毛囊干细胞存在的位置。Cotsarelis 等（1990）

图 1-2 毛囊周期性变化(Alonso and Fuchs, 2006)Figure 1-2 The hair cycle囊再生的机理尚不清楚，但普遍接受的理论是“隆突激活学说 DP 紧邻 HFSCs，HFSCs 接受来自 DP 的激活信号而被启动长期。Greco V 等（2009）提出“两步激活假说”，存于 Bulge细胞（Bulge SCs，BuSCs），次级毛芽中的干细胞称为毛芽HGSCs），他们都具有干细胞的普遍特性，但是这两类细胞进。HGSCs 最先被激活，而 BuSCs 相对静止，活化时间比较晚ulge，BuSCs 才被诱导分化形成生长期毛囊的 ORS，而且部分在下一轮毛发再生过程中形成毛芽（图 1-3）(Greco et al., 20hieh et al., 2014)。HGSCs 爆发式的增殖标志着生长期的开始。P 靠近次级毛芽。DPCs 分泌信号促进 HGSCs 的增殖分化形成 祖细胞，无论哪种机理，HFSCs 和 DPCs 之间都相当频繁地
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827


本文编号：2644278