槲皮素对角叉菜胶致奶牛蹄部真皮炎症细胞CYP450酶表达的影响

发布时间：2020-04-29 09:03

【摘要】：蹄叶炎是奶牛普通疾病中较为常见的一种,奶牛发病易导致全身症状,使得产奶量降低,为奶牛养殖带来经济损失。关于蹄叶炎的病因及机理有着许多假说和推测,但其真正机制并不十分明确。为进一步弄清这个问题,本试验采用角叉菜胶对蹄真皮细胞进行处理,诱导并建立炎症模型,然后用槲皮素对炎症细胞进行治疗,检测对细胞中炎性介质和相关通路蛋白的表达的影响,以及对细胞色素P450酶的影响,从细胞和分子的水平作为切入点,探讨在蹄叶炎发病过程中,细胞内有哪些变化。本研究中,分别采用组织块贴壁法和双酶消化法两种方法来分离培养奶牛蹄部真皮细胞,以获得生长良好的细胞。用角叉菜胶处理蹄细胞,通过MTT法测定细胞活力,收取细胞培养液,运用ELISA法检测其中炎性介质IL-1β、TNF-ɑ的水平,Western Blot法检测p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表达。结果显示,随着角叉菜胶浓度的升高,对细胞生长的抑制率也随之升高,200μg/mL的角叉菜胶处理细胞后,对细胞生长的抑制率最接近10%。该浓度的角叉菜胶处理蹄真皮细胞48 h后,p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表达升高,同时细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量显著高于对照组(P0.05)。因此,采用200μg/mL的角叉菜胶处理细胞48 h,能成功制造炎症细胞模型。通过MTT法检测槲皮素的细胞毒性,用PCR法检测其是否会直接对细胞中CYP450酶的表达产生影响。结果表明,用浓度不高于100 mmol/L的槲皮素处理奶牛蹄部真皮细胞48 h后,没有对细胞产生毒性,也未对CYP1A1、CYP3A4 mRNA的表达产生影响。以角叉菜胶建立细胞炎症模型,用几种不同浓度的槲皮素处理蹄真皮炎症细胞,通过控制槲皮素添加到细胞中的时间将其分为两个处理组,然后吸取细胞培养液,对照细胞处理前后,炎性介质IL-1β和TNF-ɑ量的变化,裂解细胞提取其中的蛋白质,检测槲皮素对p65 NF-κB和p38 MAPK两个炎症通路中的蛋白以及细胞色素P450酶的表达有何影响。根据结果得出,槲皮素可以减少炎症细胞IL-1β、TNF-α的分泌;可抑制p65 NF-κB、p38 MAPK蛋白的表达;还可以解除角叉菜胶对CYP450酶蛋白表达的抑制,以30 mmol/L浓度治疗效果最好。结论:运用双酶消化法以及组织贴壁法均获得生长良好的原代真皮细胞。以200μg/mL的角叉菜胶处理奶牛真皮细胞,作用48 h后能诱导细胞产生炎症,从而构建炎症模型。对于角叉菜胶诱导炎症细胞产生的IL-1β以及TNF-α,槲皮素能够显著减少其生成量,同时还可以抑制信号通路p65 NF-κB和p38 MAPK蛋白的表达,减轻角叉菜胶对细胞色素P450酶的抑制作用,最佳治疗浓度为30 mmol/L。
【图文】：

标尺,途径,细胞,炎症模型

形状多为三角形或梭形（图 1 A）。当培养到 9-10 d 时，有大量细胞呈放射状或旋涡状分散在组织块周围（图1 B）。经过 13 d 左右的培育后，可见细胞相互接触。双酶消化法：刚经过胶原酶消化可见大量细胞悬浮（图 1 C），细胞接种 48 h 后基本全部贴壁，体积变大，，4-5 d 后，细胞可遍布整个细胞板底，细胞走势呈束状或漩涡状（图 1 D）。A BC D注：A：培养 6 d 后组织块周围析出的原代细胞；B：培养 10 d 后细胞的排列分布；C：双酶消化法的到的细胞悬液； D：双酶消化法 5 d 后贴壁的细胞。Note: A: Primary cells deposited around the tissue block after 6 days of culture; B: Arrangement and distribution of cells after 10 days ofculture; C: Dermal cells suspension of double enzyme digestion; D: Adherent cells after 5 days of double enzyme digestion.3.2 蹄部真皮细胞炎症模型的建立3.2.1 选择角叉菜胶诱导炎症模型的最适浓度MTT 法检测细胞活力，结果表明，100 μg/mL 的角叉菜胶对细胞生长有轻微促进作用，当图 1 分别采用两种途径培养到的原代蹄真皮细胞（标尺=150 μm）Fig. 1 Primary hoof dermal cells cultured in two ways

角叉菜胶,信号通路,对照组,差异显著

图 2 角叉菜胶对蹄真皮细胞 p65NF-κB、p38MAPK 信号通路的影响Fig.2 The effects of Carrageenan on p65 NF-κB、p38MAPK in hoof dermal cells说明与对照组相比差异显著（P<0.05），**说明与对照组比较差异极显著（P<0.01）。There is a significant difference compared with the control group (P<0.05), ** indicates that the difference is extremely significanted with the control group. (P <0.01).
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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