调控miR-148a基因表达及5-Aza-dc处理对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响

发布时间：2020-04-29 18:37

【摘要】：MicroRNAs(miRANs)是一类重要的转录后调控的非编码小RNA分子,具有重要的生理调控功能。本课题组之前的研究发现,miR-148a在泌乳期和非泌乳期水牛乳腺组织中的表达有显著差异,且证明其靶基因为DNMT1,表明甲基化表观遗传修饰可能与乳腺的生理功能调控有关。为进一步了解甲基化修饰对乳腺上皮细胞功能状态的调控作用,本研究探讨了miR-148a和甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dc对水牛乳腺上皮细胞增殖及其泌乳相关基因表达的影响,取得如下研究结果。1.水牛乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定。采用泌乳期的水牛乳腺组织块进行乳腺上皮细胞培养,并用胰酶消化差异法分离纯化水牛乳腺上皮细胞。采用免疫荧光、细胞核型分析、油红O染色对其鉴定,绘制生长曲线。结果显示,组织块培养法可成功获得水牛乳腺上皮细胞,纯化的乳腺细胞具有典型上皮细胞的形态特征,具有分泌乳脂的能力,能在体外传代培养20代。2.调控miR-148a基因表达对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响。(1)为筛选miR-148a对水牛乳腺上皮细胞的合适处理浓度,通过非脂质体法分别转染miR-148a模拟物和抑制剂到乳腺上皮细胞,48 h后收集细胞,采用qRT-PCR检测靶基因DNMT1的表达。结果显示,在miR-148a过表达组中,DNMT1的表达随着模拟物浓度的增大而逐渐降低,与阴性对照组相比,50nMmiR-148a模拟物可以显著降低DNMT1的表达(P0.05);在miR-148a抑制组中,DNMT1的表达随着抑制剂浓度的增大而逐渐升高,与阴性对照组相比,30nMmiR-148a抑制剂可以显著提高DNMT1 的表达(P0.05)。(2)采用 50nMmiR-148a 模拟物和 30nM miR-148a抑制剂分别处理水牛乳腺上皮细胞48 h,检测其对细胞增殖和细胞周期的影响及对细胞周期蛋白CyclinDl及mTOR、PparG、Srebpl等泌乳相关基因表达的影响。结果发现,与阴性对照组相比,过表达miR-148a可以显著提高水牛乳腺上皮细胞的活力(P0.05)、增加有丝分裂S期细胞的比例、提高CyclinD1基因和泌乳关键基因PparG、Srebp1、Fabp3的表达(P0.05);抑制miR-148a表达可以显著降低水牛乳腺上皮细胞的活力(P0.05)、增加有丝分裂G1期细胞的比例,降低S、G2期细胞的比例、CyclinD1、Srebp1、Glut1 和 Fabp3 基因的表达显著降低(P0.05)。3.5-Aza-dc处理对水牛乳腺上皮细胞增殖及泌乳相关基因表达的影响。(1)为筛选5-Aza-dc处理水牛乳腺上皮细胞的合适浓度,在细胞培养液中分别添加 0.1μM/L、0.5μM/L、1μM/L、5μM/L 的 5-Aza-dc,72h 后收集细胞,采用qRT-PCR检测DNMT1基因的表达。结果显示,与空白组相比,添加 0.5 μM/L、1 μM/L、5 μM/L 5-Aza-dc 组中,DNMT1 基因的表达量均显著降低(P0.05),故选择低浓度0.5 μM/L5-Aza-dc进行后续试验。(2)以0.5 μM/L 5-Aza-dc处理乳腺细胞72 h,采用CCK8试剂盒检测其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期的影响;qRT-PCR技术检测其对细胞周期蛋白CyclinD1、miR-148a基因及mTOR、PparG、Srebp1等泌乳相关基因表达的影响。结果显示,与空白组相比,添加0.5 μM/L 5-Aza-dc可以提高水牛乳腺上皮细胞的活力,增加有丝分裂S期细胞的比例,显著提高CyclinD1、miR-148a、Srebp1、Csn1s1、Fabp3、E1f5 基因的表达(P0.05)。以上结果表明:miR-148a及DNA甲基化参与水牛乳腺上皮细胞的增殖及调控泌乳相关基因的表达,两者与乳腺发育和泌乳密切相关。
【图文】：

腺上皮细胞,常光,角蛋白,绿光

２．２免疫荧光法鉴定角蛋白１８邋（ＣＫ１８）的表达逡逑细胞免疫荧光法检测第３代乳腺上皮细胞的ＣＫ１８的表达情况，结果发现，水牛乳逡逑腺上皮细胞核呈红色（图１－２Ａ３、图１－２Ｂ３），细胞质中表达的细胞角蛋白１８呈绿色（图逡逑卜２Ｂ２），阴性对照成纤维细胞无绿色荧光（图１－２Ａ２），说明纯化得到的细胞为乳腺逡逑上皮细胞。逡逑ｍ逡逑Ａ１逦Ａ２逦Ａ３逡逑ｍｍｍ逡逑Ｂ１逦Ｂ２逦Ｂ３逡逑图１－２角蛋白１８鉴定水牛乳腺上皮细胞逡逑Ａ１－Ａ３：成纤维细胞（１００ｘ），Ａ１：常光，Ａ２：绿光，Ａ３：红光；Ｂ１－Ｂ３：纯化后的逡逑不规则乳腺上皮细胞（１００ｘ）邋，邋Ｂ１：常光，Ｂ２：绿光，Ｂ３：红光；逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｋｅｒａｔｉｎ邋１８逡逑Ａ１－Ａ３：邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌ（１０0ｘ）邋，邋Ａ１邋：邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ａ２：邋ｇｒｅｅｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ａ３：邋ｒｅｄ邋ｌｉｇｈｔ；逡逑Ｂ１－Ｂ３：邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｉｒｒｅｇｕｌａｒ邋ｐｏｌｙｇｏｎａｌ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋（邋１００ｘ），邋Ｂ１邋：邋ｃｏｍｍｏｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ｂ２：逡逑ｇｒｅｅｎ邋ｌｉｇｈｔ，邋Ｂ３邋：邋ｒｅｄ邋ｌｉｇｈｔ；逡逑２．３油红Ｏ染色检测

腺上皮细胞,常光,角蛋白,成纤维细胞

ＳＵＭＳ逡逑ＡＢＣ逦Ｄ逡逑图１－１水牛乳腺上皮细胞的培养（ｌ00ｘ）逡逑Ａ：成纤维细胞；Ｂ：上皮样细胞；Ｃ：长满的细胞；Ｄ：纯化后的乳腺上皮细胞逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｂｕｆｆａｌｏ邋ｂｒｅａｓｔ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｉｎ邋ｃｕｌｔｕｒｅ逡逑Ａ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗｎ邋ｆｒｏｍ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｔｉｓｓｕｅ；邋Ｂ：Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗｎ邋ｆｒｏｍ邋ｍａｍｍａｒｙ逡逑ｔｉｓｓｕｅ；邋Ｃ：Ｃｅｌｌｓ邋ｆｕｌｌ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ；邋Ｄ：Ｐｕｒｉｅｄ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．２免疫荧光法鉴定角蛋白１８邋（ＣＫ１８）的表达逡逑细胞免疫荧光法检测第３代乳腺上皮细胞的ＣＫ１８的表达情况，结果发现，水牛乳逡逑腺上皮细胞核呈红色（图１－２Ａ３、图１－２Ｂ３），细胞质中表达的细胞角蛋白１８呈绿色（图逡逑卜２Ｂ２），阴性对照成纤维细胞无绿色荧光（图１－２Ａ２），说明纯化得到的细胞为乳腺逡逑上皮细胞。逡逑ｍ逡逑Ａ１逦Ａ２逦Ａ３逡逑ｍｍｍ逡逑Ｂ１逦Ｂ２逦Ｂ３逡逑图１－２角蛋白１８鉴定水牛乳腺上皮细胞逡逑Ａ１－Ａ３：成纤维细胞（１００ｘ），Ａ１：常光，Ａ２：绿光，Ａ３：红光；Ｂ１－Ｂ３：纯化后的逡逑不规则乳腺上皮细胞（１００ｘ）邋，邋Ｂ１：常光，，Ｂ２：绿光，Ｂ３：红光；逡逑Ｆｉｇ．邋１邋－２邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｍａｍｍａｒｙ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ｋｅｒａｔｉｎ邋１８逡逑Ａ１－Ａ３：邋ｂｕｆｆａｌｏ邋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｃｅｌｌ（１０0ｘ）邋
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】