呕吐毒素脱毒型枯草芽胞杆菌的筛选及初步研究应用

发布时间：2020-04-29 20:18

【摘要】：呕吐毒素(vomitoxin,VX)属于B组单端孢霉烯族毒素,化学名称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是现已发现的霉菌毒素中检出率最高,被检出含量最高的霉菌毒素。有报道称,呕吐毒素是对动物生产造成危害最大的毒素之一,目前我国对呕吐毒素脱毒的方法多为物理处理,但因吸附毒素的同时还会吸附营养物质而未被广泛适用。近年来,益生性枯草芽胞杆菌多次被报道具有良好脱毒的效果而且还能发挥其自身益生性能,即在动物体内稳定脱毒的同时又能增强机体的肠道功能,保护肠道健康,现已成为极具发展潜力的霉菌毒素脱毒制剂。本研究从来源于动物肠道及粪便的益生菌菌株中成功筛选出兼备脱毒功能及益生性能的枯草芽胞杆菌菌株,并对其脱毒特性进行了初步研究,对其体内外脱毒效果进行验证,为研发脱毒型动物微生态制剂提供理论与技术支撑。1、益生菌菌株的筛选及鉴定以DON的类似物苯基环氧乙烷作为唯一碳元素来源对实验室益生菌菌株进行初筛,初步筛选出可在DON环境下存活的菌株6株;再以纯品DON为底物,通过脱毒复筛,选出对纯品DON脱毒效果最好的菌株WXBs-042;对筛选出的菌株进行鉴定,通过形态学观察、生化指标鉴定、16S rRNA gene鉴定、系统发育分析后,确定WXBs-042为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)。2、枯草芽胞杆菌WXBs-042生物学特性的研究生长曲线结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042在2h左右进入对数生长期,对数期为4h左右随后进入稳定期、衰退期。在抑菌性能方面,枯草芽胞杆菌WXBs-042 对沙门氏菌、大肠杆菌 K88、K99、0139、0157 有一定的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。菌株耐受性结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042能耐受高温、模拟胃液及0.3%胆盐等条件。3、枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性的研究枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒特性的研究结果表明,枯草芽胞杆菌WXBs-042对DON的脱毒效果与作用时间呈正相关关系;枯草芽胞杆菌WXBs-042对DON的脱毒效果与脱毒环境的pH无关;枯草芽胞杆菌WXBs-042发酵液不同处理组对DON的脱毒效果不同,其中发酵灭活菌处理组脱毒效果最好,脱毒率达72.16%;针对菌体-DON复合物稳定性的评价试验,证明该复合物稳定性良好。初步判定枯草芽胞杆菌WXBs-042脱毒方式为少量发酵上清降解脱毒及菌体吸附脱毒的双重作用。4、动物试验效果验证动物试验方案:空白对照组、阴性对照组、益生菌组、攻毒组、混合组、预防Ⅰ组、预防Ⅱ组及治疗组。采用集中按时灌胃的方式进行DON及益生菌的灌胃,分别在试验第14d和第28d集中剖检采样,分析各组BALB/c小鼠的生产性能、血清生化指标、观察肝脏及空肠切片的变化,分析WXBs-042在动物体内脱毒的效果及其益生的作用。1.各组BALB/c小鼠的生产性能结果表明,灌服WXBs-042能显著提高未灌胃DON的BALB/c小鼠的体重和平均日增重(P0.05),提高BALB/c小鼠的生产性能;DON攻毒显著降低小鼠体重、平均日增重(P0.05);灌服WXBs-042菌悬液能缓解DON中毒对BALB/c小鼠体重、平均日增重的影响(P0.05)。2.血清生化指标结果表明,益生菌组BALB/c小鼠的血清生化指标与空白、阴性对照组相比无显著差异(P0.05);DON攻毒组BALB/c小鼠的血清生化指标中ALT、AST指标显著高于各对照组(P0.05),而WXBs-042的添加可以显著缓解中毒现象(P0.05)。3.通过对肝脏制作病理切片并观察,发现WXBs-042菌株的灌胃不会对BALB/c小鼠的肝脏组织结构造成损伤;DON破坏BALB/c小鼠肝脏组织结构,导致炎性细胞浸润、肝细胞破裂溶解等病理学变化,WXBs-042菌株的加入能缓解该现象。4.空肠病理切片观察发现,DON破坏BALB/c小鼠空肠绒毛组织结构,可见上皮细胞脱落及肠绒毛变短等现象,WXBs-042菌株的灌胃会促进空肠绒毛生长同时缓解其它攻毒DON试验组空肠绒毛被破坏现象的发生。以上结果表明,WXBs-042既可以发挥益生作用,提高BALB/c小鼠的生产性能;又可以在动物体内发挥脱毒作用,有效缓解DON对BALB/c小鼠造成的损伤,同时预防Ⅱ组是最佳预防方式。
【图文】：

逦华中农业大学２０１９届硕士研宄生学位论文逦逡逑用孔雀石绿燃料对其芽胞状态进行染色，用光学显微镜油镜观察到的结果，两项结逡逑果表明，，菌株ＷＸＢｓ－０４２为革兰氏阳性细菌，长杆状，呈成对或链状排列形式，孢逡逑子呈中生、近中生状态，无荚膜。逡逑

以菌株ＷＸＢＳ－０４２的基因组作为起始扩增模板，利用细菌１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ通逡逑用特异引物进行ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳法初步检测扩增产物，产物大小约１．５ｋ逡逑ｂｐ。图４－４为扩增产物电泳图谱。逡逑Ｍ邋！逦２逡逑ｍｄ邋■＊．．逡逑５０００ｂｐ—＞邋ｇ逡逑３０００ｂ邋ｐ逡逑２000ｂ＾＾＾Ｈ＜－１４１９ｂｐ逡逑１０００ｂｐ￣＞逦，；＾邋，；；Ｖｖ邋＾逡逑■逡逑图４－４邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ扩增产物电泳图谱逡逑Ｆｉｇ．邋４－４邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ逡逑对ＰＣＲ扩增产物片段进行回收处理并送测序，结果如图４－５所示。将获得逡逑的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ邋ｇｅｎｅ测序结果序列登录到ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ序列比对，序列同源逡逑性分析结果为菌株ＷＸＢｓ－０４２与枯草芽胞杆菌（价（：／／／奶５＾／也５）的同源性为９９％逡逑以上。逡逑ＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＧＣＧＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＧＧ逡逑ＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＧＧＧＡＴＡＡＣＴＣＣＧＧＧ逡逑ＡＡＡＣＣＧＧＧＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＡＴＡＡＡ逡逑ＡＧＧＴＧＧＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧ逡逑ＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＣＧＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡ逡逑ＴＣＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧ
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.6

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