奶牛乳腺上皮细胞Sestrin 2基因在氨基酸调控酪蛋白合成中的作用机制

发布时间：2020-04-30 05:12

【摘要】：在奶牛乳腺上皮细胞(CMEC)中,氨基酸(AA)是酪蛋白基因表达与翻译的重要调控因子。AA主要通过雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)通路调控酪蛋白合成,但AA调控mTORC1上游通路的调控机制尚不清楚。本研究的目的是确定奶牛乳腺上皮细胞中Sestrin2(SESN2)在氨基酸调控酪蛋白合成中的作用机理,完善氨基酸调控酪蛋白合成的信号通路。SESN2负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成对CMEC进行添加全部AA、添加必需AA和不添加AA处理,用MTT比色法、流式细胞术、蛋白质免疫印记和免疫荧光等方法检测细胞增殖、细胞中酪蛋白、SESN2的表达及mTORC1通路的活化。结果表明,添加AA后,细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORCl通路的活化均显著增加,但SESN2的表达显著下降;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰处理,实验结果表明,Sesn2基因过表达后,细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORC1通路的活化均显著降低,且Sesn2基因过表达能抑制AA诱导的细胞增殖、细胞中酪蛋白的表达及mTORCl通路的活化,反之亦然。这说明,SESN2能抑制AA诱导的细胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化。SESN2通过SH3BP4负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成用免疫共沉淀(Co-IP)、QE质谱等技术鉴定SESN2的相互作用蛋白,结果表明,共鉴定到SESN2的互作蛋白108个,其中包括mTORC1上游通路相关的LAMTOR4、SH3BP4、TSC1等;试验选择SH3区域结合蛋白4(SH3BP4)进行后续研究。对CMEC进行Sh3bp4基因过表达或干扰处理,检测SH3BP4对SESN2调控mTORC1的影响。结果表明,Sh3bp4基因干扰能抑制SESN2过表达对mTORC1的抑制,反之亦然;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰处理,检测SESN2对SH3BP4与Rag　GTPase结合的影响。结果表明,SESN2过表达能促进SH3BP4与Rag　GTPase的结合,反之亦然。这说明,SESN2通过促进SH3BP4与Rag　GTPase结合来抑制mTORC1通路;对CMEC进行Atf4基因过表达或干扰,结果表明,AA缺乏通过ATF4促进SESN2的表达。SESN2通过GNG12负向调控氨基酸诱导的酪蛋白合成用SWATH鉴定CMEC的溶酶体膜蛋白,结果发现GNG12与AA诱导的酪蛋白合成有关;对CMEC进行GngI2基因过表达或干扰,结果表明GNG12能促进AA诱导的细胞增殖、酪蛋白合成和mTORC1通路活化;用Co-IP鉴定GNG12的互作蛋白,结果表明,GNG12能与Ragulator结合;对CMEC进行p18(Ragulator亚基之一)基因过表达或干扰,结果表明,GNG12通过Ragulator调控mTORC1通路;对CMEC进行Sesn2基因过表达或干扰,结果表明,SESN2抑制细胞中GNG12的表达及溶酶体定位。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,SESN2是酪蛋白合成的负调控因子。氨基酸缺乏促进ATF4表达,并使其进入细胞核,激活Sesn2的转录,上调SESN2表达,并促进表达的SESN2从两方面抑制mTORC1通路及酪蛋白合成。一是SESN2与SH3BP4结合,促进SH3BP4对Rag GTPase的抑制,从而抑制mTORC1通路的活化及酪蛋白的合成;二是SESN2抑制氨基酸诱导的GNG12的表达及其对Ragu1ator的激活,从而抑制mTORC1通路的激活及酪蛋白的合成。
【图文】：

乳蛋白,合成信号

牛奶中乳蛋白含量的高低是衡量牛奶好坏的重要指标。在奶牛体内，乳蛋白是在奶牛乳腺上逡逑皮细胞中合成的。奶牛乳腺上皮细胞中乳蛋白的合成受包括激素、营养素和环境因素等在内的多逡逑重因素调控。乳蛋白合成的调控是一个多因素、多水平的非常复杂的网络调控过程（图１－１邋ＸＢｉｏｎｚａ，逡逑ｅｔ邋ａＬ，２０１１；邋Ｏｓｏｒｉｏ，邋ｅｔａｌ＿，２０１６）。逡逑ｕ乳蛋白合成的调控因素逡逑奶牛乳腺乳蛋白合成受多种因素的调控，其中激素和营养素是两个很重要的因素（Ｙａｎｇ，邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００５；邋Ｔｏｎｇ，ｅｔａｌ．，２０１１；林忠荔，等，２０１４；周苗苗，等，，２０１５）。逡逑Ｌ１．１激素逡逑乳腺的生长发育及其各种生理功能的发挥均有赖于各种相关内分泌激素的共同作用（Ｓｔｒａｎｇｅ，逡逑ｅｔａｌ．，邋１９９１；邋０１ｉｔａｎｉ，ｅｔａｌ．，２０１１；邋Ａｏ，ｅｔａｌ．，２０１５）。参与调控的主要激素包括催乳素、胰岛素、氢逡逑化可的松、生长激素、雌激素、孕酮、肾上腺皮质激素等（Ｅｌｙ，ｅｔａｌ．，邋１９７６；邋Ｚｈａｏ，邋ｅｔａｌ．，２００７；逡逑Ｚｈａｎｇ，邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４邋）。逡逑泌乳相关激素（即：催乳素、氢化可的松和胰岛素）对乳腺上皮细胞的功能分化及启动和维逡逑持泌乳来说是非常重要的（Ａｈｎ

信号通路,溶酶体

在ｍＴＯＲＣｌ下游主要是ｍＴＯＲＣｌ被磷酸化激活后，一方面磷酸化激活Ｓ６Ｋ１，活化逡逑的Ｓ６Ｋ１磷酸化激活核糖体蛋内Ｓ６，促进蛋Ａ质的翻译；另一方面，磷酸化的ｍＴＯＲ使４ＥＢＰ１逡逑磷酸化，从而使ｅＩＦ４Ｅ从４ＥＢＰ１上释放，参与翻译起始（图１－２）（骆超超，等，２０１５）。逡逑Ａｍｉｎｓ邋ａｃｉｄｓ逦ＣＥＰＲＬＪｎｓａｉｉａ．ｅｔｅ．逡逑？？得邋｜邋？vqＴ逡逑广＾逦逦逡逑＂邋ｍＴＯ，邋一，ＰＲＡＳ４０逡逑图１－２：邋ｍＴＯＲＣｌ信号通路逡逑Ｆｉｇ．ｌ－２：邋ｍＴＯＲＣｌ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙｓ逡逑在ＡＡ对ｍＴＯＲＣｌ上游的调控，即ＡＡ如何激活ｍＴＯＲＣｌ方面，还众说纷绘，没有很明确的调逡逑控通路（Ｈａｙ，邋ｅｔａｌ．，２００４）。目前主要有如下几个调控途径。逡逑１）邋“ｉｎｓｉｄｅ－ｏｕｔ”调控模式逡逑目甜研究发现，在ＡＡ激活ｍＴＯＲＣｌ过程中，溶酶体是细胞内一个关键的细胞器，ｍＴＯＲＣ］逡逑被募集到溶酶体是其被激活的前提，即接受ＡＡ信号后，ｍＴＯＲＣｌ是先被募集到溶酶体上，然后逡逑被激活的（Ｋｉｍ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００８；邋Ｐｒｏｕｄ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１１；邋Ａｖｅｒｏｕｓ，邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）。对邋ＡＡ邋激活邋ｍＴＯＲＣｌ邋的逡逑途径，有学者根据目前的研究提出了“ｉｎＳ１ｄｅ－０ｕｔ”模式，即ＡＡ先进入溶酶体内，然后在溶酶体内逡逑部通过激活一系列信号分了进而募集并激活ｍＴＯＲＣｌ邋（Ｚｏｎｃｕ
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】