猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp12功能的探索研究
发布时间：2020-04-30 14:02
【摘要】：猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起严重威胁猪养殖业的传染病之一。20世纪80年代末至90年代初,该病最早在美国和欧洲等国家暴发和流行。PRRSV的主要特点是变异快、重组率高,这给PRRSV的防控带来巨大的挑战,而详尽研究并了解PRRSV的生物学特性,对于PRRSV的防控具有重要意义。根据生物信息学的预测与实验证实,PRRSV ORF1a区与ORF1b区共编码14个非结构蛋白(Nsp)(Fang and Snijder,2010)(Fang and Snijder,2010)。其中Nsp1与PRRSV的亚基因组mRNAs的合成相关。Nsp2与Nsp3参与复制相关复合体DMVs(double membrane vesicles)的形成。目前研究认为,PRRSV病毒的复制在DMVs上进行。Nsp4编码3C样丝氨酸蛋白酶。除此之外,Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4和Nsp11被证实与PRRSV抑制天然免疫信号通路相关。ORF1b区域编码4个Nsps(Nsp9至Nsp12),Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),Nsp10是RNA解旋酶,已经有相关的报道证实Nsp9与Nsp10是高致病性PRRSV的致病基础。Nsp11具有核酸内切酶活性与去泛素化酶活性,此外Nsp11具有抑制NLRP3炎症小体与调节细胞周期的作用。在整个ORF1b区域,唯有Nsp12的功能尚不明确,并未见其相关报道。Nsp12含153 aa,其分子量为17 kDa,位于ORF1b区末端,能够提高IL-1β和IL-8的表达。除此之外,HSP70是研究比较明确的与Nsp12相互作用的蛋白质。抑制HSP70的表达能够显著降低病毒mRNA的合成及病毒的复制。本研究主要对Nsp12对病毒复制的影响及相关的生化特性进行分析。通过对不同PRRSV毒株间的Nsp12序列进行保守性分析;在感染性克隆的基础上构建Nsp12的缺失病毒,探索其对复制的影响;对Nsp12二聚化的现象及二硫键的特性进行相关的探索;在本实验室构建的复制子系统的基础上,对Nsp12是否参与病毒RNA的合成等问题进行相关的研究。研究表明,不同PRRSV毒株间Nsp12的氨基酸序列具有高度的保守性。Nsp12缺失不能够拯救病毒,表明Nsp12参与进PRRSV的复制并且对于PRRSV的复制至关重要。生化分析结果显示Nsp12容易被氧化形成二聚体及多聚体,Nsp12与N蛋白的二聚体形成都是由于细胞裂解后空气氧化形成二硫键,与N蛋白不同的是,Nsp12二聚体不存在于成熟的病毒粒子中。对Nsp12中3个半胱氨酸突变分析表明,第35位和79位Cys联合突变不能拯救出病毒,说明第35位和79位Cys对于PRRSV的复制至关重要。最后,构建了可以评价PRRSV负链RNA合成能力的复制子系统,并通过该系统初步证明只有ORF1a和ORF1b共同表达时才会有效的启动PRRSV负链RNA的合成,同时也初步证实Nsp12参与进了病毒RNA的合成过程。本研究初步探索了Nsp12的生化特性及功能,将为该蛋白的生物学功能探索奠定基础。
【图文】：
图 1.1 PRRSV 粒子结构模式图(Lunney ethematic representation of PRRSV virion（Cited from物学特征单股正链 RNA，3′端有多聚腺苷酸的尾巴分别是 ORF1a、ORF1b 和 ORF2-7 区(SnijRF1a 和 ORF1b 主要编码 PRRSV 的复制酶ins，Nsp）编码区。ORF2-7 编码病毒的结GP5、膜蛋白 M 和核衣壳蛋白 N (Meulenbl., 2000; Meulenberg, 2000; Murtaugh et al., 1成分是 GP5 和 M 蛋白，，它们由二硫键连 PRRSV 的感染性克隆中将编码两者的基因GP5 和 M 蛋白的主要功能是参与病毒结构 的功能还涉及到病毒粒子最初与细胞的结多的研究表明 GP5 上含有中和表位，并且 1997)。此外 M 蛋白上也存在中和表位(Ya
农业科学院硕士学位论文 第一ten et al., 1996) 。此外，已有相关的报道证实 Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4 和 Nsp11 与 PRR免疫信号通路相关(Beura et al., 2010; Fang and Snijder, 2010; Li et al., 2010; Shi et et al., 2010; Yoo et al., 2010)。ORF1b 区域编码 4 个 Nsps (Nsp9～12)，Nsp9 具有 RN 聚合酶（RdRp）的活性，Nsp10 具有 RNA 解旋酶的活性，杨汉春团队证实 Nsp9 致病性 PRRSV 的致病基础(Li et al., 2014)。Nsp11 具有核酸内切酶活性与去泛素化酶., 2011; Wang et al., 2015)。此外，Nsp11 具有抑制 NLRP3 炎症小体与调节细胞周期的., 2014)。据相关报道，Nsp3、Nsp5、Nsp6、Nsp7 和 Nsp8 非结构蛋白与病毒毒力相., 2008)。尽管对 PRRSV 的研究非常广泛，但我们仍然对某些病毒蛋白的结构和功尤其是非结构蛋白 Nsp12。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
本文编号：2645840
【图文】：
图 1.1 PRRSV 粒子结构模式图(Lunney ethematic representation of PRRSV virion（Cited from物学特征单股正链 RNA，3′端有多聚腺苷酸的尾巴分别是 ORF1a、ORF1b 和 ORF2-7 区(SnijRF1a 和 ORF1b 主要编码 PRRSV 的复制酶ins，Nsp）编码区。ORF2-7 编码病毒的结GP5、膜蛋白 M 和核衣壳蛋白 N (Meulenbl., 2000; Meulenberg, 2000; Murtaugh et al., 1成分是 GP5 和 M 蛋白，，它们由二硫键连 PRRSV 的感染性克隆中将编码两者的基因GP5 和 M 蛋白的主要功能是参与病毒结构 的功能还涉及到病毒粒子最初与细胞的结多的研究表明 GP5 上含有中和表位，并且 1997)。此外 M 蛋白上也存在中和表位(Ya
农业科学院硕士学位论文 第一ten et al., 1996) 。此外，已有相关的报道证实 Nsp1α/β、Nsp2、Nsp4 和 Nsp11 与 PRR免疫信号通路相关(Beura et al., 2010; Fang and Snijder, 2010; Li et al., 2010; Shi et et al., 2010; Yoo et al., 2010)。ORF1b 区域编码 4 个 Nsps (Nsp9～12)，Nsp9 具有 RN 聚合酶（RdRp）的活性，Nsp10 具有 RNA 解旋酶的活性，杨汉春团队证实 Nsp9 致病性 PRRSV 的致病基础(Li et al., 2014)。Nsp11 具有核酸内切酶活性与去泛素化酶., 2011; Wang et al., 2015)。此外，Nsp11 具有抑制 NLRP3 炎症小体与调节细胞周期的., 2014)。据相关报道，Nsp3、Nsp5、Nsp6、Nsp7 和 Nsp8 非结构蛋白与病毒毒力相., 2008)。尽管对 PRRSV 的研究非常广泛，但我们仍然对某些病毒蛋白的结构和功尤其是非结构蛋白 Nsp12。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 杨汉春,管山红,尹晓敏,甘孟侯;猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与初步鉴定[J];中国兽医杂志;1997年10期
2 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
相关硕士学位论文 前3条
1 刘杰;猪繁殖与呼吸综合征病毒颗粒定量检测及纯化方法的研究[D];内蒙古农业大学;2016年
2 田娇;PRRSV N蛋白与非结构蛋白互作的筛选和验证[D];西北农林科技大学;2015年
3 陶冶;HP-PRRSV HuN4株感染性克隆和嵌合病毒的构建及致病性分析[D];中国农业科学院;2014年
本文编号：2645840
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