PLD6作为猪未分化精原细胞的分子标记鉴定
发布时间：2020-04-30 23:58
【摘要】：未分化的精原细胞是存在于雄性睾丸内的成体干细胞,具有维持自我更新和分化产生精子的能力,是雄性体内源源不断地产生精子的基础。对其生物学特性的研究有助于理解精子发生的过程,揭示雄性生殖系干细胞自我更新和分化的机制。但是,未分化精原细胞在睾丸中数量稀少,且缺少特异性的分子标记,严重阻碍了其相关研究与应用。有研究报道,磷脂酶D家族成员6(PLD6)在小鼠未分化精原细胞表达。为了鉴定PLD6能否作为猪未分化精原细胞的分子标记,本研究旨在探究猪雄性生殖细胞中PLD6的表达分布特点,从而优化其富集方法,提高纯化效率。同时,尝试建立一个猪的未分化精原细胞的无饲养层培养体系,为雄性生殖干细胞的后续研究奠定基础。主要研究结果如下:(1)采集初生期、初情期和成年期的不同物种的睾丸组织,通过免疫组织化学技术PLD6在睾丸组织中的表达及分布。结果表明PLD6在性成熟前猪睾丸的精原细胞中特异性表达,且PLD6在小鼠、山羊和公牛的睾丸中的表达模式与其在猪上的表达模式一致。(2)通过PLD6与已知分子标记的免疫双荧光染色检测性成熟前的猪睾丸组织中表达PLD6蛋白的细胞类型。结果表明,PLD6在猪未分化精原细胞中特异性表达。(3)采取两步酶消化法和差异贴壁对性成熟前猪睾丸细胞进行初步的富集,台盼蓝染色结果表明细胞活率为95%。接着采用PLD6标记通过MACS进一步富集未分化精原细胞。通过Western Blot,qRT-PCR,流式分析鉴定分选前后的细胞类群。流式细胞分析表明,PLD6~+细胞富集了约8.5倍的未分化精原细胞。QRT-PCR、Western Blot结果表明,精原干细胞相关分子标记在PLD6~+细胞中高表达,而在PLD6~-细胞和未分选细胞中低表达;相反,体细胞相关的分子标记则在PLD6~-细胞和未分选细胞中高表达。这证明PLD6可作为性成熟前猪未分化精原细胞的分子标记,用于富集猪的未分化精原细胞。(4)异种移植鉴定PLD6~+细胞的生物学功能,并比较富集效率。将PLD6~+细胞和未分选细胞用PKH26荧光染料进行标记并分别移植到百消安处理的受体小鼠睾丸中,8周后采集受体睾丸组织检测曲细精管中带有荧光标记的细胞克隆数目。结果表明PLD6~+细胞可在受体睾丸曲细精管中定植并增殖,产生的克隆数目是未分选细胞产生的克隆数目的9倍,表明PLD6~+细胞富含精原干细胞。(5)体外无饲养层条件下培养PLD6~+细胞,并鉴定细胞类型。通过建立一个无饲养层的培养体系,可以在体外培养PLD6~+细胞,维持未分化状态4周时间,并在整个培养期间表达未分化精原细胞的分子标记。表明PLD6~+细胞仍具有干细胞特征。综上所述,本研究表明PLD6可以作为猪未分化精原细胞的表面分子标记物,可用于高效富集性成熟前猪的未分化精原细胞。本项研究发现为进一步研究猪未分化精原细胞的体外培养奠定了基础,也为后续PLD6在其它物种雄性生殖细胞上的研究提供了理论参考。
【图文】：
未分化精原细胞中的 Asingle精原细胞是 SSCs(Olive and Cuzin细胞间胞质桥连接形成链状的 Apaired、Aaligened精原细胞在 Asingle缺失时能胞并去分化形成 Asingle，以维持干细胞数量和恢复精子发生过程 (Brinrmann 1994; De Rooij 2017; Yoshida 2012)。故广义上也可认为 A 型精原细原细胞是 SSCs。之后 A 型精原细胞发生分化依次形成 In 型、B 型精原细，再经过减数分裂产生圆形精细胞，最后生成精子。而在灵长类动物中，胞则分为 Adark和 Apale(Boitani et al. 2016; Ehmcke et al. 2006a; Ehmc。Adark精原细胞是储备型干细胞，只在青春期间和外在因素导致精原细胞恢复精原干细胞的自我更新 (Simorangkir et al. 2005)。相反，Apale精原细周期有规律地进行自我更新和增殖，是 SSCs 的主要成分 (Ehmcke et ae et al. 2005b)。然而，这一主张仍有争议，有待进一步研究。但不可否认的有限分裂对精子发生产生了巨大的影响，不同物种之间差异显著。例如的 A 型精原细胞能分裂产生数千个精细胞；而在人类中，一个 A 型精原最多产生 40 个精细胞(Di Persio et al. 2017)。图 1-1 总结了啮齿动物和灵长过程的差异 (Schlatt and Ehmcke 2014)。
精原干细胞的微环境（niche）参与调控了精原2015）。Niche 的结构基础是支持细胞和管周肌样细胞组ne 2007)。其中，支持细胞是一类极化柱状上皮细胞，，通信号以支持精子发生和生殖细胞分化(Griswold 1998)。成血睾屏障（BTB），将生精上皮分为基底区和近腔区中起重要作用 (Cheng and Mruk 2002)。BTB 维持腔内性物质流动，从而为在生精小管的近腔区的单倍体生殖外，将正常的支持细胞移植到不育受体的睾丸中发现受精子发生，证明了支持细胞对生殖细胞分化的重要性(Katsu-Shinohara et al. 2003b)。在小鼠中，将从胚胎不同阶丸 niche 中，能在曲细精管定植甚至产生精子，具有生05; Nayernia et al. 2005; Ohta et al. 2004)。这些发现表明生殖细胞提供了独特的微环境。但是 niche 的具体的细和分子功能尚不完全清楚。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
本文编号：2646321
【图文】：
未分化精原细胞中的 Asingle精原细胞是 SSCs(Olive and Cuzin细胞间胞质桥连接形成链状的 Apaired、Aaligened精原细胞在 Asingle缺失时能胞并去分化形成 Asingle，以维持干细胞数量和恢复精子发生过程 (Brinrmann 1994; De Rooij 2017; Yoshida 2012)。故广义上也可认为 A 型精原细原细胞是 SSCs。之后 A 型精原细胞发生分化依次形成 In 型、B 型精原细，再经过减数分裂产生圆形精细胞，最后生成精子。而在灵长类动物中，胞则分为 Adark和 Apale(Boitani et al. 2016; Ehmcke et al. 2006a; Ehmc。Adark精原细胞是储备型干细胞，只在青春期间和外在因素导致精原细胞恢复精原干细胞的自我更新 (Simorangkir et al. 2005)。相反，Apale精原细周期有规律地进行自我更新和增殖，是 SSCs 的主要成分 (Ehmcke et ae et al. 2005b)。然而，这一主张仍有争议，有待进一步研究。但不可否认的有限分裂对精子发生产生了巨大的影响，不同物种之间差异显著。例如的 A 型精原细胞能分裂产生数千个精细胞；而在人类中，一个 A 型精原最多产生 40 个精细胞(Di Persio et al. 2017)。图 1-1 总结了啮齿动物和灵长过程的差异 (Schlatt and Ehmcke 2014)。
精原干细胞的微环境（niche）参与调控了精原2015）。Niche 的结构基础是支持细胞和管周肌样细胞组ne 2007)。其中，支持细胞是一类极化柱状上皮细胞，，通信号以支持精子发生和生殖细胞分化(Griswold 1998)。成血睾屏障（BTB），将生精上皮分为基底区和近腔区中起重要作用 (Cheng and Mruk 2002)。BTB 维持腔内性物质流动，从而为在生精小管的近腔区的单倍体生殖外，将正常的支持细胞移植到不育受体的睾丸中发现受精子发生，证明了支持细胞对生殖细胞分化的重要性(Katsu-Shinohara et al. 2003b)。在小鼠中，将从胚胎不同阶丸 niche 中，能在曲细精管定植甚至产生精子，具有生05; Nayernia et al. 2005; Ohta et al. 2004)。这些发现表明生殖细胞提供了独特的微环境。但是 niche 的具体的细和分子功能尚不完全清楚。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 黄文强;邢万金;;piRNA的生物学功能[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年09期
2 尹明,李德雪;体外培养条件下SCF、LIF与bFGF对昆明白小鼠精原干细胞增殖的影响[J];生物工程学报;2002年06期
相关博士学位论文 前1条
1 于雪;水牛精原干细胞的体外培养与鉴定及转基因干细胞的异种移植[D];华中农业大学;2014年
本文编号：2646321
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