Alternaria oxytropis内生真菌酵母氨酸还原酶基因表达分析及其启动子克隆

发布时间：2020-05-01 16:47

【摘要】：小花棘豆(Oxytropis glabra)为多年生棘豆属草本植物,其体外分离培养得到的Alternaria oxytropis内生真菌可生成有毒生物碱苦马豆素(swainsonine,SW),牲畜取食至一定量,出现中毒症状,引起细胞功能紊乱,严重者致死,给畜牧业带来极大损失。而酵母氨酸还原酶(Sac)在内生真菌中合成SW代谢途径中起到关键作用。本研究以Alternaria oxytropis内生真菌OW7.8菌株为研究对象,管家基因ACTIN、TUB、GAPDH、APRT、18S rRNA为候选内参基因进行qRT-PCR,Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件共同进行分析评价,筛选内生真菌最适的内参基因;在不同培养时间、添加不同前体物(a-氨基己二酸(L-A)、赖氨酸(L-Lys)、哌啶酸(L-P))及不同前体物浓度(0 mol/L、1×10~-33 mol/L、3×10~-44 mol/L、1×10~-44 mol/L和1×10~-55 mol/L)条件下,利用HPLC-MS检测内生真菌SW动态水平、利用qRT-PCR分析酵母氨酸还原酶基因(sac)的表达;克隆sac启动子序列,构建其表达载体pBARGPEI-mCherry-sac,并进行转录激活功能的检测;提取内生真菌的Sac,对其酶活、最适pH值、最适温度、酶动力学、K_m和V_(max)值等基础酶学性质进行分析。为探索内生真菌中sac对SW合成的影响提供了基础数据。主要研究结果如下:1.Alternaria oxytropis内生真菌的最适内参基因为ACTIN。2.添加L-A、L-Lys和L-P的实验组真菌的SW水平和sac表达量均高于对照组。sac表达与SW水平呈对应关系:sac表达量高,SW水平高;sac表达量低,则SW水平低。添加相同浓度L-Lys、L-A及L-P(1×10~(-4)mol/L)后,真菌SW水平和sac表达量分别在23d、26d和32d达最大值;培养26d而L-A的添加浓度为3×10~-44 mol/L、培养23d而L-Lys添加浓度为1×10~-44 mol/L、培养32d而L-P的添加浓度为1×10~(-4) mol/L时,内生真菌SW水平和sac表达量分别为最高。添加相同浓度的L-Lys、L-A和L-P(1×10~(-4) mol/L)时,L-Lys添加组在培养23d时真菌SW水平和sac表达量高于L-A和L-P添加组;而L-P添加组在培养26d、29d和32d时真菌SW水平和sac表达均高于L-A和L-Lys添加组。3.利用TAIL-PCR法克隆到sac启动子序列,经PLACE和BDGP在线软件进行功能元件预测,发现含TATA-box、CAAT-box、G-box和7个与胁迫相关的作用元件。构建pBARGPEI-mCherry-sac启动子表达载体,并将该表达载体转化至OW7.8原生质体,经再生培养得sac启动子转录激活功能株(抗草胺磷),经PCR检测到融合目的序列,经RT-PCR检测到mCherry基因的转录,在荧光显微镜(红光)下检测到菌株有红色荧光,而野生株OW7.8无,说明sac启动子实现了转录激活功能。4.提取OW7.8的Sac,其最适pH值为7.0;最适反应温度为24℃;最适反应时间为10 min;当底物NADP~+不变时,酵母氨酸最适浓度为1mmol/L、Sac的K_m=0.118 mmol/L、V_(max)=0.063μmol/min;当底物酵母氨酸不变时,NADP~+最适浓度为2 mmol/L,Sac的K_m=0.375 mmol/L、V_(max)=0.213μmol/min。
【图文】：

合成代谢,途径,酵母氨酸

ccharopine reductase;Sac)，催化 α-氨基己二酸半醛生成酵母氨酸(L-saccharopine) 是种有毒生物碱又名吲哚兹定三醇(indolizidine triol)，化学式是 C8H15NO3[6legate 等在 1979 年首次从灰苦马豆(Swainsona canescens)中分离得到 SW[6]。卢在内蒙古不同地区的小花棘豆中分离得到 SW[17]。Harris等1988年对豆科丝核菌(Rhixoctonia leguminicola)中的SW生物合成途径了推测，提出以下主要通路：赖氨酸(L-lysine；L-Lys)→酵母氨酸→L-2-氨基己半醛(L-2-Aminoadidpic acid,L-A)→1,6-二六氢哌啶酸(△1-piperideine-6 carboxylC)→2-六氢哌啶酸(哌啶酸，L-Pipecolic acid；L-P)→1-酮基吲哚里西啶，随后分过顺式羟基吲哚里西啶和反式羟基吲哚里西啶两条途径分别生成根霉菌氨和SW着Wickwire等在1990年对代谢途径进行深入研究提出SW代谢途径可能是：赖氨酸氧化酶酵母氨酸SacL-2-氨基己二酸半醛构型变化1,6-二六氢哌啶酸1,6-二六氢哌啶酸还原酶酸+丙二酸乙二酸哌啶还原、环化1-羟基吲哚里西啶还原、羟化1,2,8-3羟基吲哚里西)[19]。豆科丝核菌中SW合成代谢途径如图1-1。

序列,合成代谢,途径,赖氨酸

图 1-2 M.anisopliae 中 SW 合成代谢途径Fig1-2 SW Metabolic Pathway in M.anisopliae2012年通过标记赖氨酸的C、N进行示踪实验，发现加α-酮戊二酸、赖氨酸和哌啶酸对SW动态水平研的内生真菌中SW水平高于未添加的实验对照组[21酸、赖氨酸、哌啶酸和聚乙二醇对内生真菌生长不[22]。在 2014 年对内蒙古的 O.glabra 体外分离得到内生A序列(NCBI登录号:KJ944635)，简并PCR克隆到s048)，，与从美国疯草内生真菌的 sac 的 cDNA 序列失载体[23]，获得 sac 缺失突变株 M1[24]，通过 Sou间片段已被敲除，且 hph 整合到 M1 的基因组中到酵母氨酸含量在 M1 中低于 OW7.8[26]。接着课题
【学位授予单位】：内蒙古师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S812.6

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