猪圆环和猪流感病毒的分离鉴定、遗传演化分析及致病性研究

发布时间：2020-05-04 17:04

【摘要】：猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)和猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)是猪群中常见的两种病毒,在世界范围内广泛流行并能够引起多种猪的疾病,对养猪业造成了严重的经济损失。PCV是单链环状DNA病毒,自1974年首次发现PCV1以来,目前在猪群中流行的基因型有3种,其中PCV2对猪群有较强的致病性。PCV3是2016年首次在美国的母猪流产胎儿当中发现的,同PCV2相比较二者之间Cap基因的同源性较低,由于PCV3是一种新的PCV基因型,目前关于PCV3流行病学调查数据和检测方法还不是很完善。SIV是分8个基因片段的负链RNA病毒,在猪群中主要流行的基因型为H1N1、H1N2和H3N2,由于不同来源的流感病毒能够在猪体内发生重组且流感病毒可以从猪传播到人群中,因此对于SIV的流行病学调查及致病性研究具有重要的兽医公共卫生学意义。本研究对2016至2018年间山东省、天津市和上海市及周边地区猪场中疑似猪圆环病毒相关疾病的病料进行采集处理,通过建立PCV2和PCV3双重PCR方法对采集病料进行检测,发现PCV3的阳性率为32.7%且存在PCV2和PCV3混合感染的情况(PCV2和PCV3混合感染的阳性率为15.2%)。表明PCV3目前已经在猪群中广泛流行。将阳性病料接种PK-15细胞进行病毒分离实验,只成功分离鉴定到2株PCV2毒株。对代表毒株遗传演化分析,结果显示分离到的两株PCV2属于PCV2b-1A和PCV2b-1C两个亚型,7株不同地区PCV3代表毒株属于PCV3a亚型,与GenBank中登录的PCV3序列的全长与Cap基因的同源性分别为97.6%-99.4%和97.1%-99.1%。为探究PCV3 Cap蛋白抗原性,本研究通过原核表达方式,获得了可溶性表达的去核定信号肽重组蛋白pCold TF-dPCV3-Cap,通过Western blot实验证明该重组蛋白具有良好的反应原性和特异性。为制备针对于PCV3 Cap的单克隆抗体,本研究利用构建的真核表达质粒pCAGGS-PCV3-Cap免疫小鼠,细胞融合后进行阳性杂交瘤细胞株的筛选和亚克隆纯化,经间接免疫荧光鉴定,结果显示有3株杂交瘤细胞株上清能够与PCV3 Cap蛋白发生特异性反应,其中一株3G10的反应效果最好。为了解猪流感病毒的流行情况及其致病性,本研究对2018年于山东某猪场采集到的病料进行分离鉴定,获得3株二源重组H1N1 SIV,遗传演化分析结果表明,其两个表面基因HA和NA来源属于欧洲类禽亚型,其他6个内部基因的来源属于2009年甲型流感病毒。为探究分离到的毒株对哺乳动物的致病性,本研究将代表毒株A/Swine/Shandong/L1/2018(H1N1)在小鼠模型上进行滴鼻感染攻毒实验,结果显示代表毒株对小鼠呈现较高的致病性,能够导致小鼠体重产生明显下降,小鼠死亡率为100%;代表毒株能够在小鼠肺脏中很好地复制,病毒感染对小鼠肺脏产生明显的组织病理学损伤。
【图文】：

退火温度,双重PCR

图 2.1 双重 PCR 不同退火温度扩增结果.2.1 Effect of annealing temperature on detection of two viruses by double P(DL2000); 1: 50 C; 2: 52 C; 3: 54 C; 4: 56.4 C; 5: 58.8 C; 6: 61.2 C; 7: 6310: 70 C; 11: 阴性对照L2000); 1: 50 C; 2: 52 C; 3: 54 C; 4: 56.4 C; 5: 58.8 C; 6: 61.2 C; 7: 63.6

循环数,双重PCR

图 2.2 双重 PCR 不同循环数扩增结果Fig. 2.2 Effect of number of cycles of double PCR分子量标准(DL2000); 1: 25 个循环; 2: 30 个循环; 3: 35 个循环; 4: 40 个A Marker (DL2000); 1: 25 cycles; 2: 30 cycles; 3: 35 cycles; 4: 40 cycles; 5:
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651

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