TsGLS基因沉默对旋毛虫抗酸能力及其蛋白免疫保护研究

发布时间：2020-05-04 09:58

【摘要】：旋毛虫病是最重要的食源性人畜共患疾病之一,分布于世界各地。旋毛虫病不仅会造成重大经济损失,还危及人类健康。本实验利用RNA干扰技术探究旋毛虫谷氨酰胺依赖性抗酸机制的重要性。通过浸泡法将三条特异性的TsGLS-siRNA导入旋毛虫肌幼虫,筛选出一条沉默效果最佳的TsGLS-siRNA;将转染siRNA的肌幼虫放在pH2.5、pH4、pH6.6、pH9的培养液中,从存活率、基因表达水平、虫体酶活性、培养液pH变化、Gln缺失等检测TsGLS基因沉默对肌幼虫耐酸能力的影响;将转染siRNA的肌幼虫经口接种小鼠,观察TsGLS基因沉默对肌幼虫胃液内耐酸能力、肌幼虫减虫率以及子一代耐酸能力的影响。通过基因水平和蛋白水平分析,siRNA-881组肌幼虫TsGLS表达量比PBS组分别降低72.82%和55.44%,成功从三条TsGLS-siRNA筛选出干扰效果最佳的siRNA-881。TsGLS基因沉默对肌幼虫体外抗酸能力影响检测中,存活率结果显示,在pH2.5、2 h时存活率明显低于其他酸性环境下,siRNA-881组肌幼虫减虫率仅为PBS对照组的48.33%。虫体酶活性检测结果显示,在pH2.5、0.5 h时谷氨酰胺酶活性最高,为1.67 U/mg,pH4次之,pH9时没有活性。培养液pH变化结果显示,通过pH计测量培养溶液的pH值,并且当培养溶液起始pH为pH4时,pH变化最显著。在pH4环境中培养1 h,与PBS组相比,siRNA-881干扰后pH值上升低了1.7,且随着时间增长,差距越小。通过检测谷氨酰胺的缺失对抗酸能力的影响,结果显示,体外添加10μM谷氨酰胺能提高TsGLS基因表达,且siRNA-881沉默TsGLS效果好于BPTES。TsGLS基因沉默对肌幼虫体内抗酸能力影响检测中,用转染siRNA的肌幼虫接种小鼠后,检测7 d成虫减虫率和35 d肌幼虫减虫率分别为61.64%和66.71%。检测其保姆细胞厚度结果显示,与PBS组相比,siRNA-881组(15.90±1.301)厚度降低了39.78%。siRNA处理肌幼虫TsGLS基因沉默遗传性分析,与亲代相比,子一代的基因表达量较亲代降低32.70%。由此证明,旋毛虫具有谷氨酰胺依赖性抗酸系统,利用RNA干扰技术也已明显降低肌幼虫抗酸能力。为了评价旋毛虫TsGLS、TsGAD重组蛋白诱导小鼠的免疫保护效果,分别将TsGLS、TsGAD、TsGLS+TsGAD重组蛋白分别与佐剂混匀免疫BALB/c小鼠后,检测血清中特异性抗体水平的变化,并检测重组蛋白体外刺激小鼠脾淋巴细胞产生的细胞因子水平;在加强免疫小鼠后,通过攻击试验检测并比较7天成人和35天肌肉幼虫的蠕虫减少率,以及免疫小鼠在攻虫后第7、14、21、35天产生的细胞因子水平。血清中特异性抗体检测结果显示,用TsGLS和TsGAD重组蛋白免疫的小鼠可诱导机体产生混合的Th1/Th2免疫应答,每个免疫组血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)检测结果显示,IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平均有所增加,且以IgG_1(Th2)的抗体水平增加最显著。增殖实验结果表明,经TsGLS和TsGAD重组蛋白刺激后,脾淋巴细胞数量显著增加,以TsGAD重组蛋白刺激最显著。ELISA检测培养液中细胞因子分泌情况结果显示,IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10含量均显著增加。ELISA检测血清中细胞因子结果显示,IL-4和IL-10的水平在攻击后第14天达到最高水平,IFN-γ和IL-12水平在攻虫后第7天达到最高。攻虫试验结果显示,TsGLS、TsGAD和TsGLS+TsGAD小鼠中的成虫和肌肉幼虫为35.55%、49.24%、37.34%和47.05%、60.01%、46.55%。上述研究结果表明,TsGLS和TsGAD重组蛋白均能诱导小鼠获得免疫保护效果,且TsGAD重组蛋白免疫效果最佳。两部分实验表明,旋毛虫肌幼虫具有谷氨酰胺依赖性抗酸系统,利用RNA干扰技术也已明显降低肌幼虫抗酸能力,为预防旋毛虫病提供了一条新思路。谷氨酰胺酶可以作为一种候选旋毛虫病疫苗。
【图文】：

旋毛虫肌幼虫,荧光标记,旋毛虫

东北农业大学农学硕士学位论文果 siRNA 导入到旋毛虫肌幼虫体内浸泡法将荧光标记的 Control siRNA 转染到旋毛虫肌幼虫体内，并分别在显微镜观察。图 3-1 中显示，6 h 时只有少量肌幼虫有荧光信号，12 h 时转上，说明浸泡 12 h 后，Control siRNA 已经被成功导入到旋毛虫肌幼虫体到实验标准。在荧光显微镜下明显观察到荧光信号主要集中于旋毛虫小肠ol siRNA 可能为旋毛虫吞食进入体内。

旋毛虫肌幼虫,基因转录,水平变化,转染

-2 siRNA 处理后旋毛虫肌幼虫 TsGLS 基因转录水平xpression level of TsGLS in Trichinella spiralis muscle treatmentot 在蛋白水平检测 siRNA 对 TsGLS 表RNA-881、siRNA-1429 分别转染到肌幼虫体内，在平检测。与 PBS 对照组相比，siRNA-419、siRNA别降低 7.74%、55.44%、35.52%，而 Control siRNA组（P>0.05），见图 3-3。siRNA-881 对 TsGLS 表达检测 TsGLS mRNA 表达量结果相一致。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7

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