FABP4基因过表达及siRNA干扰对鹅卵泡颗粒细胞激素分泌影响的研究

发布时间：2020-05-03 21:05

【摘要】：脂肪型脂肪酸结合蛋白,又称为脂肪酸结合蛋白4(FABP4)或aP2,是脂肪酸结合蛋白(FABPs)家族中的一员,能结合多种疏水性化合物,在脂肪和卵巢组织中分布广泛,参与脂肪酸的合成代谢,作用于卵巢组织,调控禽类产蛋过程中蛋的脂肪酸营养沉积,从而对禽类产蛋中脂肪酸的沉积起到重要作用,有利于产蛋性能的提高。课题组前期筛选差异表达蛋白时发现,产蛋高峰期豁眼鹅FABP4的表达量升高。鉴于此,本研究选取鹅卵泡颗粒细胞,探讨FABP4对鹅卵泡颗粒细胞生殖激素分泌的影响,为揭示FABP4对禽类产蛋性能的作用及机理奠定理论基础。本研究首先构建FABP4基因的真核表达载体。通过采集豁眼鹅卵巢组织提取组织总RNA,逆转录,PCR扩增后得到FABP4基因的目的片段,连接转化后构建克隆载体pMD18T-FABP4,双酶切后将FABP4基因片段连接到真核表达载体pcDNA3.1上,构建pcDNA3.1-FABP4过表达载体;然后,分离培养原代豁眼鹅卵泡颗粒细胞,利用该细胞进行FABP4基因的干扰和过表达转染试验,分成空白,阴性对照,FABP4-siRNA干扰,pcDNA3.1-FABP4过表达这四个试验组,采集转染后的各组细胞上清液用酶联免疫吸附试验法验证FABP4对雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的影响,并在mRNA和蛋白表达水平上探讨FABP4对鹅卵巢激素合成和分泌相关基因CYP11A1和CYP19A1的影响,从而探讨FABP4对豁眼鹅产蛋性能影响的分子基础。试验结果为:(1)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FABP4;(2)成功分离出豁眼鹅卵泡颗粒细胞并进行体外培养;(3)成功转染FABP4-siRNA干扰引物和pcDNA3.1-FABP4过表达载体进入豁眼鹅卵泡颗粒细胞中;(4)所采集的细胞上清液中E_2和P_4含量检测发现,RNA干扰组显著低于空白组和阴性对照组(P0.05),过表达组显著高于空白组和阴性对照组(P0.05);(5)检测CYP11A1和CYP19A1 mRNA和蛋白水平的表达量发现,RNA干扰组均显著低于对照组(P0.05),过表达组均显著高于对照组(P0.05)。本研究结果表明,FABP4可通过干预CYP11A1和CYP19A1的表达,影响体外培养的鹅卵泡颗粒细胞E_2和P_4的分泌。
【图文】：

示意图,母鸡,卵泡,原始卵泡

2016）。形不断变化，按照原始卵泡、生长卵泡和2014）。原始卵泡是卵泡发育的初级阶段在皮细胞组成，该卵泡发育成下一阶段，即的初级卵泡（A. Johnson et al.，2007）。生此阶段较原始卵泡有很多变化，卵黄开始大激增，外周逐渐膨胀变大，卵泡外层产上皮组织，此时形成的卵泡是次级卵泡（熟卵泡是卵泡发育的最后一个阶段，此时经成型不再分层，个体变得更大，并完全于卵巢组织上，卵泡柄是卵泡输送营养物分方式

核苷酸序列,干扰原理

图 1-2 RNA 干扰原理图（引自ike.baidu.com/pic/RNA%E5%B9%B2%E6%89%B0/3743635/0/08f790529822720e17f21fab54?fr=lemma&ct=single#aid=0&pic=08f790529822720e1782f5d579cb0a46f21Fig 1-2 RNA interference principle (fromike.baidu.com/pic/RNA%E5%B9%B2%E6%89%B0/3743635/0/08f790529822720e17f21fab54?fr=lemma&ct=single#aid=0&pic=08f790529822720e1782f5d579cb0a46f2Ai 的特性及优势Ai 的特性主要有五个方面：① 整个过程发生在转录之后，所以没有翻反应的进行；② 因工作原理针对于内源 mRNA 片段便可达到较高的沉默目的 mRNA 片段的效果；③ 在 Dicer 酶的解离下 dsRNA 被酶较少的核苷酸序列就能起到沉默目的基因的表达，使基因结构发生变高效；④ 任何反应都需要时间来进行，对基因的沉默反应同样如此的前提下，，瞬时转染 siRNA 需要 36~48h 达到干扰效果；⑤ 由于干核中作用于 mRNA 片段上，在成功沉默目的基因后，伴随细胞的有干扰的片段是可以将沉默效果延续给子代，因此该手段具有延续性（唐
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S835

【参考文献】