山东省水貂胴体及内脏组织四种病原菌调查、分离鉴定

发布时间：2020-05-03 20:55

【摘要】：水貂是重要的毛皮用经济动物,目前以人工养殖为主。我国水貂养殖量居世界第一位,其中山东省的养殖量占全国70%以上。伴随取皮后而产生的大量水貂胴体及其内脏引起了国内广泛关注,它们作为副产品的开发较少。由于国内外对水貂胴体成分尚缺乏科学的认识和加工技术,水貂胴体利用或处理十分混乱,它们有被养殖户直接加工于饲料中用于其它毛皮动物的喂养,也有被加工成“野味食品”,也有被深埋或丢弃处理的,这给生态环境以及毛皮动物养殖带来了相当大的生物安全隐患。本研究旨在对取皮后水貂胴体及内脏组织中主要病原菌大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌开展调查研究,为水貂胴体及内脏组织生物安全评估和科学利用提供依据。首先根据大肠杆菌的phoA基因、沙门氏菌的invA基因、肺炎克雷伯氏菌khe基因和金黄色葡萄球菌的nuc基因的保守序列设计四对特异性引物,优化反应体系和退火温度,建立检测四种病原的多重PCR方法,对其特异性、敏感性和稳定性进行分析;收集山东省水貂主产区诸城、文登、聊城、日照、海阳等地区水貂胴体及内脏样品,对其四种病原菌开展检测;对阳性样品中病原菌进行常规分离培养、生化鉴定。结果显示,所研制的多重PCR方法能扩增出四种病原菌的核酸片段大小分别为:622?bp(大肠杆菌)、801?bp(沙门氏菌)、303?bp(肺炎克雷伯氏菌)和464?bp(金黄色葡萄球菌),对貂源魏氏梭菌、绿脓杆菌和链球菌等无特异性扩增;该方法对相应四种病原菌的灵敏度分别为1.0?pg/μL、10.0 pg/μL、10.0?pg/μL和1.0 pg/μL,且结果稳定、重复性较好。用该方法对收集的268份水貂胴体及内脏组织检测发现,四种致病菌的阳性检出率为37.69%(101/268),其中大肠杆菌的检出率为33.96%(91/268),肺炎克雷伯氏菌为2.61%(7/268),沙门氏菌为0.75%(2/268),金黄色葡萄球菌为0.37%(1/268),肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌双重感染为2.61%(7/268)。阳性样品中分离鉴定出83株大肠杆菌,2株沙门氏菌,7株肺炎克雷伯氏菌和1株金黄色葡萄球菌。以上结果表明,成功建立能够特异检测貂源大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌的四重PCR方法;四种病原菌在取皮后水貂胴体及内脏组织中存在不同程度的感染,其中大肠杆菌感染率最高。
【图文】：

退火温度,肺炎克雷伯氏菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌

图 1 单一 PCR 退火温度的优化Fig. 1 Amplification of single PCR under the condition of different annealing temperatureM, D2000 DNA maker；1, 52.0 ℃；2, 52.9 ℃；3, 53.8 ℃；4, 54.9 ℃；5, 56.0 ℃；6, 57.0 ℃；7, 58.1 ℃；8, 59.2 ℃；9,60.1 ℃；10, 61.0 ℃A.大肠杆菌；B.肺炎克雷伯氏菌；C.沙门氏菌；D.金黄色葡萄球菌；

退火温度,多重,多重PCR

图 2 多重 PCR 退火温度的优化Fig. 2 Amplification of multiplex PCR under the condition of different annealing temperatureM, D2000 DNA maker；1, 52.0 ℃；2, 52.9 ℃；3, 53.8 ℃；4, 54.9 ℃；5, 56.0 ℃；6, 57.0 ℃；7, 58.1 8, 59.2 ℃；9, 60.1 ℃；10, 61.0 ℃
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

【参考文献】