蛋白酶体β5亚基调节捻转血矛线虫生长发育的功能研究

发布时间：2020-05-05 06:38

【摘要】：捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是一种寄生在牛、羊等反刍动物胃肠道内以吸食血液为生的寄生性线虫,可以造成被感染的宿主贫血、营养不良甚至死亡。随着寄生线虫抗药性的不断增加,寻找有效的解决方法迫在眉睫。而虫体繁殖迅速及生长发育过程中适应性强是捻转血矛线虫病流行的主要原因,因此对于捻转血矛线虫生殖等过程相关的基因的研究,能够为开发有效的新型疫苗以及寻找药物靶标提供理论基础。真核生物细胞内的26S蛋白酶体在正常情况下可以降解多种蛋白质,对于调节细胞周期以及细胞的存活与凋亡具有重要的作用。26S蛋白酶体主要由20S中心粒子和19S调节粒子两部分构成,且在中心粒子上具有六个活性位点,其中两个活性位点位于β5亚基上,具有胰凝乳蛋白酶样活性,该活性位点能够切割疏水性氨基酸残基,是蛋白酶体活性的主要组成。所有具有催化活性的亚基必须与其相邻亚基共同合作才能与底物相结合继而发挥水解作用,可见蛋白酶体的完整性对于其发挥正常功能至关重要。在寄生原虫中,蛋白酶体功能的研究已经取得了一定的成果,但是在蠕虫中的研究时至今日仍有待进一步研究。据研究报道β5亚基是决定20S蛋白酶体总体水解活性水平的限速因子。因此在本研究中,探索了捻转血矛线虫中的蛋白酶体β5亚基的结构和功能。在酿酒酵母、人类以及绦虫中,抗癌药物硼替佐咪(BTZ)可以通过其硼酸基团与蛋白酶体β5亚基特定的氨基酸位点结合而抑制胰凝乳蛋白酶活性,通过将Hc-PBS-5氨基酸序列与具有BTZ结合位点的物种(已报道)的同源氨基酸序列进行比对后,在Hc-PBS-5氨基酸序列中发现了抑制剂的结合位点以及酶活性位点。并且通过体外胰凝乳蛋白酶活性实验得出硼替佐咪能够成功抑制Hc-PBS-5的活性。利用抑制剂硼替佐咪分析Hc-PBS-5在虫体细胞进程及发育过程的作用,并结合RNA干扰技术研究β5亚基编码基因Hc-pbs-5在捻转血矛线虫生长发育过程中发挥的重要功能。研究结果如下:(1)Hc-PBS-5氨基酸序列的分析通过使用生物信息学方法分析Hc-PBS-5氨基酸序列表明,Hc-PBS-5氨基酸序列与多种线虫PBS-5蛋白氨基酸序列Clustal X比对后发现其具有高度保守的序列。并且在保守序列中发现Ntn(即N端具有亲核类氨基酸)蛋白水解酶亚家族的特征序列、金属结合位点、抑制剂结合位点以及胰凝乳蛋白酶活性位点。且氨基酸序列的末端亲水性强,疏水性弱,呈亲水性。另外,使用同源建模软件SWISS-MODEL获得Hc-PBS-5具有酷似“三明治”样的三级结构。亚细胞定位的结果显示Hc-PBS-5主要定位在细胞核,是一种胞内蛋白酶。在其氨基酸序列中也未发现潜在的信号肽以及跨膜区,所以认为Hc-PBS-5既不是膜上的受体也不是分泌型蛋白。(2)Hc-PBS-5在捻转血矛线虫中的定位在大肠杆菌中表达pE-SUMO-Hc-PBS-5重组蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,利用免疫荧光技术定位蛋白的表达位置。发现蛋白主要表达在虫卵以及雌雄虫前后端肠道以及生殖器官和组织中。(3)硼替佐咪体外抑制实验使用脱鞘的三期幼虫的蛋白提取物进行蛋白酶体胰凝乳蛋白酶活性实验可知硼替佐咪对于捻转血矛线虫胰凝乳蛋白酶活性具有高效的抑制性,IC50值可达0.6μM。使用BTZ对脱鞘的三期幼虫进行体外抑制实验,经过7 d的培养,x L3期幼虫向L4期幼虫发育的发育率与对照组比较明显降低。使用BTZ对虫卵进行体外抑制实验,在高浓度抑制剂实验组中,虫卵的孵化率与对照组比较降低明显,低浓度抑制剂实验组中,虫卵的孵化速率与对照组比较相对减慢,但最终的孵化率没有显著性差异,经过7 d的培养后,实验组中幼虫的存活率较对照组明显降低并且在显微镜下观察到抑制剂实验组中存在比正常虫体短且粗的发育不良虫体。(4)Hc-pbs-5基因的干扰实验向培养基中添加dsRNA浸泡脱鞘的三期幼虫,通过荧光定量检测Hc-pbs-5基因的转录水平发生明显的下调。从虫体接触dsRNA开始浸泡24 h,靶基因被有效的抑制。幼虫经过培养7 d后,虫体活力明显下降(未统计),脱鞘的三期幼虫向四期幼虫的发育的发育率比空白对照组下调52.42%左右。基因表达下调不仅阻滞了虫体的发育,还导致了虫体的存活率降低。
【图文】：

蠕虫卵,虫卵,花生凝集素

在一端或者两端出现新月型的空隙，因经分裂增殖后的虫卵卵胚细微镜下观察形似桑葚，，故又被称为“桑葚胚”(汪明 2009)。毛圆科线虫上微小的差异使得在物种水平上的虫卵鉴定非常困难(图 1-1-1)，仅使用察进行虫卵鉴定不够可靠，1996 年 Palmer 和 McCombe 阐明花生凝集素特异性结合捻转血矛线虫的虫卵卵壳。2010 年以后，Jurasek 和 Hillrichs

过程图,捻转血矛线虫,幼虫,口器

- 2 -图 1-1-2 捻转血矛线虫 L3 期幼虫口器发育的过程如图 A-F：L3 期幼虫到 L4 期幼虫的发育Fig. 1-1-2 Development of mouth cavity of third-stage larvae of Haemonchus contortusFrom L3 stage to L4stage in Fig.A-F(Sommerville 1966; The Journal of Parasitology)
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.731

【参考文献】