外泌体和自噬在山羊副流感病毒3型感染中的作用研究

发布时间：2020-05-05 10:44

【摘要】：山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3,CPIV3)是2013年发现的一种新病毒,主要导致羊呼吸道疾病,山羊感染率高达56%,而绵羊感染情况尚未见报道。CPIV3致病力较强,传播速度快,给养羊业健康发展带来了新的威胁。目前对CPIV3研究较少,缺乏对其复制、感染、传播和致病机制的深入认识,在该病防控中缺乏理论支撑。因此,本研究在明确CPIV3在绵羊中流行态势的基础上,系统地研究了外泌体和自噬在CPIV3复制、传播及维持细胞微环境稳定中发挥的重要作用。为评价CPIV3在我国绵羊主产区的流行情况,本研究从抗体和病原两个方面分别对2012年的1,163份和2016~2017年的1,863份绵羊血清样品进行检测,抗体阳性率分别为50.3%(585/1,163)和64.9%(1,210/1,863),病原阳性率为21.5%(401/1,863)。说明绵羊普遍存在CPIV3感染。所鉴定的11株CPIV3毒株经M基因和全基因组序列进化分析显示,绵羊CPIV3和山羊CPIV3亲缘关系极近,具有高度同源性。为鉴定外泌体携带的信息物质,首先用超速离心法结合CD63免疫磁珠法纯化CPIV3感染的MDBK细胞外泌体,经外泌体分子标志检测、形态观察、粒径分析和蔗糖密度梯度离心分析,证明所获囊泡符合外泌体特征,且CPIV3感染可促进细胞分泌外泌体。然后经蛋白质谱、Western blot、小RNA测序和qRT-PCR鉴定发现,CPIV3外泌体(CPIV3-exo)携带病毒蛋白、病毒RNA以及miRNA,且外泌体对装载的miRNA具有明显选择性。靶基因预测及分析显示,CPIV3感染相关miRNA的靶基因参与调控细胞自噬相关通路。为进一步分析外泌体在CPIV3感染中的作用,将PKH67标记的CPIV3-exo与MDBK细胞共孵育,荧光观察证明细胞可主动摄入外泌体。CPIV3-exo处理MDBK细胞后,经检测病毒蛋白和RNA发现,CPIV3-exo可介导病毒生产性感染,且病毒复制效率高于CPIV3,但其感染可被CPIV3阳性血清所阻断。检测自噬标志分子LC3B和p62的结果显示,CPIV3-exo与CPIV3均可抑制细胞自噬。而且,与CPIV3感染组相比,细胞因子IFN-α和oas1表达水平显著下调。说明CPIV3-exo通过抑制细胞自噬和细胞因子的表达更有效地介导病毒生产性感染。那么,自噬是否与CPIV3复制相关?经诱导细胞自噬后检测病毒复制水平,发现胞内外病毒蛋白显著下降,而RNA水平升高。进一步纯化细胞的外泌体并检测其标志蛋白,结果显示,诱导自噬后细胞分泌的外泌体减少,而外泌体中携带的病毒蛋白和RNA增加。Western blot检测表明,诱导自噬的细胞内CD63和HSP70表达水平均显著下降,且与CPIV3滴度呈正相关。说明诱导细胞自噬后,不但使CPIV3复制水平降低,而且抑制外泌体的形成和释放,还促进病毒蛋白和RNA进入MVBs。为进一步探究CPIV3感染中自噬与外泌体形成和释放之间的关系,用外泌体抑制剂GW4869处理CPIV3感染细胞,抑制外泌体的分泌,发现外泌体携带的病毒蛋白和RNA水平也随之降低。但CD63和病毒F蛋白蓄积在细胞内,且二者可共定位。说明抑制细胞外泌体的释放,使病毒蛋白随MVBs滞留于细胞内。Western blot分析、荧光检测和电镜观察还发现,在CPIV3感染情况下抑制外泌体分泌,可促进细胞自噬。综上所述,CPIV3感染在绵羊和山羊中普遍存在,且毒株具有极高同源性;CPIV3在细胞内增殖过程中,病毒、外泌体与自噬之间存在复杂的调控网络。CPIV3感染可抑制细胞自噬,但促进外泌体分泌,外泌体被靶细胞摄入后可介导高效的生产性感染;诱导细胞自噬,可抑制CPIV3复制及外泌体的形成和释放;而抑制外泌体分泌时,自噬水平升高,且大量病毒蛋白和RNA储存于MVBs中并随之蓄积于细胞内。自噬与外泌体途径在CPIV3感染中过程中互相平衡,这种调控机制维持了细胞内环境的稳定,在CPIV3的高效复制、传播中发挥重要作用。上述研究结果不仅有助于阐明CPIV3感染和传播机制,而且对深入研究病毒与宿主相互作用机制,制订科学合理的防控措施具有重要意义。
【图文】：

脂类,蛋白,读数,受体细胞

.1 外泌体携带不同蛋白、RNA 和脂类（Harendra S, et al. Virusig. 1.1 Exosomes contain specific repertoires of proteins, RNAs an白之外，外泌体还携带不同的 RNA 进入受体细胞。丰富，占原始测序读数的 42.32%，占匹配成功读数的核糖体 RNA（rRNA）、长链非编码 RNA（lncRNA））等其它种类 RNA（图 1.1）。外泌体 miRNA 运送到

自噬,膜融合

图 1.3 自噬与外泌体分泌之间的关系(Baixauli et al., 2014)Fig. 1.3 Interaction between autophagy and exosome release pathways在巨自噬过程中，MVBs 可以选择与细胞膜融合进入外泌体分泌途径，或与溶酶体噬途径。研究证明 ESCRT 突变与自噬和 MVB 形成息息相关，ESCRT 突变后，自噬内体系统发生膜融合，从而不能形成完全自噬(Rusten et al., 2007)。通过构建不同 ES
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.27

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