Galectin-1和Galectin-3调控猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的相关研究

发布时间：2020-05-06 12:58

【摘要】：猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前危害全球养猪业重要病原之一。研究病毒编码蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用对于理解PRRSV的致病机制具有十分重要的意义。本研究在筛选、鉴定与PRRSV非结构蛋白11和12(Nsp11、Nsp12)相互作用宿主蛋白的基础上,进一步选取Galectin-1和Galectin-3为研究目标,分析了其分别与Nsp11、Nsp12发生相互作用的生物学意义,以期为阐明PRRSV的致病机制提供科学依据。分别将含有PRRSV Nsp11和Nsp12基因的酵母质粒pGBKT7转化酵母菌Y2H Gold进行细胞毒性和自激活实验,结果表明,Nsp1 1和Nsp12基因编码的蛋白无细胞毒性和自激活现象。应用猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库和酵母双杂交技术,分别筛选与Nsp11、Nsp12相互作用的细胞蛋白,将阳性克隆进行质粒提取和测序分析,并在NCBI上进行序列比对,确定相应序列对应的基因和相互作用的候选蛋白。利用酵母回复杂交和免疫共沉淀试验证实Nsp11与Galectin-1、Nsp12与Galectin-3之间存在相互作用。将编码猪Galectin-1、Galectin-3的基因序列分别克隆入真核载体PCAGGS。过表达Galectin-1、Galectin-3可显著抑制不同毒力、不同基因型PRRSV毒株在MARC-145细胞上的复制,且Galectin-1的抑制作用更加强烈。进一步研究发现,将原核表达的Galectin-1蛋白孵育MARC-145细胞,也可引起PRRSV复制的显著抑制,且作用的强弱与Galectin-1蛋白浓度在一定范围内呈正相关。为探讨Galectin-1是否具有广泛的抗病毒作用,过表达Galectin-1后分别感染马动脉炎病毒、伪狂犬病毒(PRV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)和乙型脑炎病毒(JEV),结果显示,过表达Galectin-1对PRV、PEDV、CSFV、JEV的复制呈不同程度的抑制,提示Galectin-1的广谱抗病毒作用。
【图文】：

表明Ｎｓｐｌｌ和Ｎｓｐｌ２均不能激活逡逑ＡＵＲ１－Ｃ、ＭＥＬ１报告基因，艮Ｐ无自激活作用（图２．１Ｂ）。逡逑（Ａ）逦［邋Ｎｓｐｌｌ邋｜邋［邋Ｎｓｐｌ２邋｜邋｜邋ｐＧＢＫＴ７邋｜邋｜逦［邋＋邋｜逡逑＾□ＯＯＱＱ逡逑（Ｂ）逡逑ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／Ｘ／ＡｂＡ邋■逡逑图２．１诱饵蛋白的毒性（Ａ）和自激活（Ｂ）检测逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐＧＢＫＴ７邋ｐｌａｓｍｉｄｓ．逡逑２．２．２候选蛋白筛选逡逑将转化有ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌｌ、ｐＧＢＫＴ７－Ｎｓｐｌ２的酵母菌株逡逑Ｙ２ＨＧｏｌｄ与转化有ｃＤＮＡ文库的酵母菌株Ｙ１８７进行接合形逡逑成二倍体细胞，，涂布于ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ平板进行初筛，逡逑再将长出菌落点涂到邋ＳＤ／－Ｌｅｕ／－Ｔｒｐ／－Ｈｉｓ／Ａｄｅ／Ｘ－ａ－Ｇａｌ／ＡｂＡ邋平逡逑板，挑选变蓝的菌落。对蓝色阳性菌落的酵母质粒中插入的逡逑片段进行ＰＣＲ鉴定，利用核酸凝胶回收（图２．２），进行测序逡逑分析和ＢＬＡＳＴ比对。逡逑１４逡逑

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【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

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本文编号：2651297