山羊背最长肌发育过程中circRNAs的鉴定及circPAPD7和circQKI的功能研究

发布时间：2020-05-06 18:42

【摘要】：动物骨骼肌的发育是一个受到多种转录因子和多条信号通路调控的复杂过程,以往关于骨骼肌发育的调控研究主要集中在mRNA、miRNA和lncRNA方面。近年来的研究表明circRNA在肌肉的发育过程中呈动态表达,并参与骨骼肌发育的调控,但目前关于山羊骨骼肌发育过程中circRNA的表达模式及机制研究还未见报道。基于此,本研究以简州大耳羊发育不同阶段即妊娠期45d(E45)、60d(E60)、105d(E105)及出生后3d(B3)、60d(B60)、150d(B150),共12只母羔的背最长肌组织为研究材料,利用去线性RNA的方法富集circRNA后进行RNA测序,鉴定山羊骨骼肌发育过程中表达的circRNA并对circRNA的基因组特征、表达模式及功能进行分析。此外,本研究还以山羊骨骼肌卫星细胞(SMSCs)为实验材料,研究了circPAPD7以及circQKI对SMSCs增殖和分化的影响,并对其作用机制进行了解析,主要研究结果如下。1.12个测序文库总共获得964,968,566条读长为150 nt的双末端clean reads,总共产生约144.76 Gb的数据。其中有78.10%~85.56%的clean reads能比对到山羊基因组(GCF_001704415.1)上,有48.85%~55.95%的序列具有唯一的基因组位置。2.在山羊背最长肌的6个发育时期中共鉴定出14,655个circRNA,总共对应4801个来源基因。circRNA在山羊染色体上均匀分布且无染色体偏好性,约90%的circRNA来源于外显子区域,83.5%的circRNA转录本含有两个及以上的外显子,山羊circRNA的GC含量和外显子数目均少于mRNA。山羊circRNA的侧翼序列包含较长的内含子。3.6276个circRNA在6个发育阶段中共表达;时序表达分析中circRNA显著富集的表达模式共有14个,14个表达模式总共包括8136个circRNA;功能富集分析发现,共表达的circRNA及STEM分析显著的circRNA对应的来源基因均能显著富集到肌动蛋白细胞骨架调控、MAPK信号通路、甲状腺激素信号通路和Wnt信号通路等骨骼肌发育相关的信号通路中。共有1336个circRNA的表达量在不同发育阶段两两之间存在显著差异,层次聚类分析显示差异表达的circRNA按不同发育阶段聚集成了6组且严格按出生前和出生后聚成了两大部分。4.在14,644个circRNA中总共预测到746,525个miRNA的结合位点,circRNA与miRNA的结合呈现“多对多”的关系且miRNA的结合位点数在circRNA中呈现不均等分布。与circRNA结合的miRNA包含miR-1、miR-206和miR-133等肌肉特异性的miRNA,说明circRNA可作为miRNA的分子海绵参与肌肉发育的调控。5.利用RT-PCR和qPCR验证了RNA-seq得到的circRNA的环化位点和表达趋势,RT-PCR测序得到环化位点与RNA-seq得到的环化位点一致且两种定量方法所得到的表达趋势具有很高的相关性(r=0.93~0.99),表明RNA-seq测序结果可靠。6.circPAPD7含有miR-26a-5p的结合位点,在SMSCs中过表达circPAPD7能极显著上调增殖相关基因PCNA、Pax7以及miR-26a-5p靶基因EZH2的表达并促进细胞增殖,同时过表达circPAPD7显著下调成肌分化相关基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和miR-26a-5p的表达并抑制肌管形成;抑制circPAPD7的表达则导致增殖相关基因及EZH2的表达下调并抑制细胞增殖,同时成肌分化相关基因及miR-26a-5p的表达上调且肌管数增多。通过AgO2-RIP实验进一步验证circPAPD7、miR-26a-5p及EZH2可通过ceRNA机制促进山羊SMSCs的增殖并抑制分化。7.circQKI在背最长肌发育过程以及SMSCs增殖、分化过程中的表达变化与其来源基因QKI的表达趋于一致。过表达circQKI后增殖相关基因PCNA和Pax7、成肌分化相关基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和来源基因QKI的表达均极显著上调并促进细胞增殖以及肌管的形成;抑制细胞内源性circQKI的表达后,上述增殖、分化基因及来源基因QKI的表达均下调同时新增细胞核及肌管数目减少。说明circQKI可通过上调QKI基因的表达促进山羊SMSCs的增殖和分化。本研究通过对山羊骨骼肌组织circRNAs的筛选鉴定以及circPAPD7、circQKI参与调控山羊SMSCs的增殖分化机制的解析,为深入揭示山羊骨骼肌发育过程中的分子机制提供了参考依据。
【图文】：

品种、性别、激素、营养水平、年龄、运动量等因素的影响外还受到细胞因子和转录因子的调控。1.1.2 骨骼肌生长发育的转录调控动物骨骼肌的生长发育是一个受到多种转录因子和细胞信号通路调控的复杂生理过程(图 1-1)。其中 Pax 基因家族(Paired-homeobox family)、生肌调节因子(myogenic regulatory factors, MRFs)和肌细胞增强因子 2(myocyte enhancer factor 2,MEF2) 相互作用调节下游肌生成相关基因的表达，进而调控肌肉的生长发育及肌肉再生。此外，Wnt 信号通路、BMP4 信号通路、p38 MAPK 信号通路等通过调控生肌调节因子的表达，维持肌肉发育过程中增殖和分化的平衡。

lncRNA 不具有完整的开放阅读框，不能编码蛋白质。此外，lncRNA 的保守性和表达丰度一般低于 mRNA，，但其时空特异性高于 mRNA[62]。lncRNA 可分别与 DNA、RNA 和蛋白质结合，从表观水平、转录和转录后水平等不同层面参与机体的生长发育和生理活动。如图1-2所示，lncRNA的作用机制主要包括：(1) lncRNA 可结合在编码基因的上游启动子区域，干扰编码基因的转录；(2) 通过染色质重构和组蛋白修饰影响下游基因的表达；(3)与前体 mRNA 结合，影响编码基因的可变剪接；(4) 产生内源性小干扰 RNA，调控基因的表达；(5) 与特定的蛋白结合充当核酸蛋白复合体的组成部分；(6) 结合到蛋白质上改变其活性或者亚细胞定位；(7)作为 miRNA 等小 RNA 的前体，转录产生 miRNA；(8) 作为 miRNA 的分子海绵，调节 miRNA 靶基因的表达。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827

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本文编号：2651697