小檗碱通过miRNA-18b调控猪体外受精胚胎发育的分子机制

发布时间：2020-05-06 21:10

【摘要】：体外受精胚胎的体外培养是胚胎体外生产技术的重要环节。胚胎质量直接影响胚胎发育和胎儿生长。本研究首先观察了小檗碱(Berberine,Ber)和miRNA-18b对猪体外受精胚胎发育率、囊胚细胞增殖及凋亡的影响;其次,探讨Ber和miRNA-18b对猪体外受精胚胎内miRNA-18b、IGF-I、IGF-IR和HIF-1α在转录和翻译水平的调控作用,以及检测miRNA-18b的直接靶基因是否为IGF-I、IGF-IR和HIF-1α;最后探讨了Ber和miRNA-18b对AKT通路的调控关系,为提高猪体外受精胚胎体外发育提供理论及数据支持。试验以未添加Ber的NCSU-23胚胎基础培养液为对照组,Ber加入NCSU-23培养液中为Ber组,在对照组的原核胚细胞质中显微注射miRNA-18b过表达剂(agomir)、低表达剂(antagomir)和阴性片段分别为miRNA-18b agomir组、miRNA-18b antagomir组和NC组。观察IVF胚胎2-、4-、8-细胞和桑椹胚、囊胚发育率;囊胚细胞差异染色法、Hoechst33342-TUNEL法分别观察内细胞团和滋养层细胞数、细胞总数和囊胚细胞凋亡数;通过qRT-PCR、Western-blot和双荧光素酶报告基因的方法验证miRNA-18b的靶基因IGF-I、IGF-IR和HIF-1α;Western-blot检测AKT磷酸化水平。结果:Ber和miRNA-18b antagomir,可显著提高猪IVF胚胎发育率、囊胚内细胞团、滋养层、总细胞数和和细胞总数以及内细胞团细胞占细胞总数比率(P0.01或P0.05),极显著降低囊胚细胞凋亡数(P0.01),提高了猪IVF胚胎的发育质量。在4-、8-细胞和桑椹胚期,Ber极显著地下调miRNA-18b的水平,而且miRNA-18b的水平随着胚胎发育呈下降趋势,4-~8-细胞时期更为明显;在4-、8-细胞和桑椹胚期,Ber和miRNA-18b antagomir能显著上调猪IVF胚胎中IGF-I、IGF-IR和HIF-1α表达水平(P0.01或P0.05),miRNA-18b agomir显著下调IGF-I、IGF-IR和HIF-1α表达水平(P0.01或P0.05);IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的表达水平随着胚胎发育呈上升趋势,4-~8-细胞阶段更为明显;双荧光素酶报告基因结果表明在IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的3’UTR wt、mut重建载体转染产生的双萤光素酶活性上,miRNA-18b与NC组均无显著差异(P0.05)。Ber和miRNA-18b antagomir可极显著提高AKT磷酸化水平(P0.01),miRNA-18b agomir能下调AKT磷酸化水平;AKT磷酸化水平随着胚胎发育呈上升趋势,4-~8-细胞阶段更为明显。结论:Ber能够通过下调4-、8-细胞和桑椹胚时期miRNA-18b的转录水平,促进IGF-I、IGF-IR和HIF-1α的表达,进而促进AKT的磷酸化,促进猪IVF胚胎细胞的增殖和体外发育,其中4-~8-细胞时期作用更为明显。然而,有关猪IVF胚胎中miRNA-18b的直接靶基因的问题还有待今后进一步的研究验证。
【图文】：

章 microRNA 对 IGF-I/ IGF-IR/HIF-1α 及 A的生理调控研究进展NA（miRNA）是长度为 20~24 个核苷酸的非编码 RNA，调控基因转 最初被转录为具有茎-环结构的初级 miRNA，并在被核糖核酸酶 II（IR切割后，成为前体 miRNA（pre-miRNA），紧接着输出蛋白 5 将 pre-m细胞质中。RNaseIII 酶 Dicer 切割 pre-miRNA 以产生中间 RNA 双链链体获得的 1~22-nt 长成熟 miRNA 链加载到含有 Argonaute 的 RNAISC）中并通过调控 miRNA 的靶基因表达水平发挥作用[5,6]（图 1）。一个 mRNA，一种 mRNA 可能是许多 miRNA 的靶基因[7,8]。目前，已经了超过 700 种 miRNA[9]。

图 2 IGF-I 的信号通路[10]IGF-I 可以与 IGF-IR 结合，，IGF-IR 由四个 α 和两个 β 亚基组成的四聚体跨膜。IGF-I 配体与 IGF-IR 的结合通过 IGF-IR 的自身磷酸化导致受体活化。IG种衔接蛋白（包括 IRS 和 Shc）的募集和磷酸化，IGF 受体底物 IRS-1 或 IR PI3K-PDK1-AKT 信号通路，而 Shc 的磷酸化激活 RAS、RAF 和细胞外信原活化蛋白激酶信号通路。通过 PDK1 在苏氨酸 308 处或 mTORC2 在丝氨酸激活 AKT 通过多种机制促进细胞存活，包括抑制细胞凋亡和诱导促存活基因调节 GSK-3β 活性和蛋白质合成以及细胞生长[51]，AKT 磷酸化阻断 GSK3β蛋白质合成和细胞存活的真核翻译起始因子 2B（eIF2B）的去磷酸化和活化使结节性硬化蛋白（2TSC2）激活，从而激活mTOR1，之后激活S6K和eIF4E释 eIF4E 可以将核糖体导向 mRNA 的帽结构，以促进帽依赖性翻译，促进蛋白GF-IR 轴的主要功能之一[53]。另一条平行途径 RAS-RAF-MAPK 刺激细胞增 miRNA 对 IGF-I 和 IGF-IR 的调控影响.1 生殖方面
【学位授予单位】：北京农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828

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本文编号：2651863