Gga-miR-7b调控功能靶基因及其在鸡马立克氏病致瘤过程中的作用研究

发布时间：2020-05-07 07:41

【摘要】：鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD)是由马立克氏病毒(Marek’disease virus,MDV)引起的免疫抑制和淋巴细胞肿瘤性禽病。近年来,尽管MD可用商品化的疫苗来保护,但MD的不断爆发已导致MDV的毒力增强,其致病性也逐渐增大,MD仍然是一个严重的威胁,给世界养殖业带来巨大的经济损失。因此,需要增强现有疫苗的控制措施以及寻找新的替代策略。宿主MicroRNA(miRNA)在转录后调控水平发挥多种生物学功能,它们可能在诱导MD肿瘤形成过程中发挥重要的调控作用。我们前期以自主培育的B21(抗性)和B19(易感)单倍型SPF鸡为模型,利用高通量测序技术构建了B21和B19鸡在MDV病毒感染三个关键阶段(5、14和25dpi)脾脏组织miRNA的差异表达谱,发现gga-miR-7b显著差异表达。因此,我们以gga-miR-7b作为研究目标进行深入研究。(一)利用Targetscan和miRDB两个生物学软件分别预测gga-miR-7b的靶基因,取二者交集并结合GO分析筛选与肿瘤、免疫等相关的靶基因,共筛选出5个候选靶基因(VDAC1、KLF4、SATB1、SNCA、TCF12)。(二)采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析上述候选靶基因在B21、B19单倍型SPF鸡MDV感染三个关键阶段(5、14和25dpi)脾脏组织的表达变化规律。通过qRTPCR结果分析,我们选取VDAC1、KLF4、SNCA进行候选靶基因验证。(三)利用双荧光素酶报告基因系统进行gga-miR-7b的候选靶基因体外验证,结果显示:gga-miR-7b可以结合到VDAC1、SNCA的mRNA 3’UTR区,抑制萤火虫荧光素酶活性(p0.05)。qRT-PCR和Western blot检测发现,gga-miR-7b抑制VDAC1基因的mRNA和蛋白表达(p0.05)。上述结果证实了VDAC1是gga-miR-7b调控的靶基因。(四)运用CCK-8和Transwell小室实验分析gga-miR-7b和VDAC1对MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移的影响。结果显示:gga-miR-7b可抑制MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移(p0.05);利用siRNA敲低VDAC1后,MDCC-MSB1细胞的增殖则受到了抑制(p0.05),同时降低了MDCC-MSB1细胞的迁移,尽管没有达到显著水平。更有趣的是,敲低VDAC1后,MDV致瘤基因Meq的mRNA表达也受到了显著抑制(p0.05)。综上所述,本研究证实了VDAC1是gga-miR-7b调控的功能靶基因,并且gga-miR-7b可能通过调控VDAC1抑制MDCC-MSB1细胞的增殖和迁移。gga-miR-7b及其调控的靶基因VDAC1很可能与MD肿瘤形成及MDV感染有关。
【图文】：

马立克氏病,发病机制,疫苗

图 1-1 马立克氏病发病机制的四个阶段Fig.1-1 Four stages of the pathogenesis of Marek's disease1.1.2 鸡马立克氏病的防控现状自 1907 年首次报道 MD，随后在美国、英国和荷兰等国家检测到了 MD 的发生案例[18]。值得注意的是，在致癌性疱疹病毒病原学发现之后，在 20 世纪 70 年代早期开发了一种能有效防控 MD 的疫苗，特别是活的 HVT 疫苗[19-20]。20 世纪 70 年代后期，由于田间菌株毒力的增加导致更多的 MD 爆发，直到 20 世纪 80 年代开始使用二价疫苗（SB-1+HVT）和后来减毒血清型 1 Rispens/CV1988 疫苗[21-22]。所有这些都是与细胞相关的病毒性疫苗。MD 疫苗是世界上第一种能够预防病毒诱发的癌症疫苗[23]。减毒 Rispens 疫苗是通过血清型1 MDV 的连续体外传代开发的，该过程是用已知降低 MDV 毒株在体内生长的能力以及扩增病毒基因组的 IR 区域中的串联直接重复序列构成[24]。Rispens 疫苗是迄今为止对抗 MDV超强毒株（vv）和超超强毒株（vv+）最有效的疫苗，对易感禽类的接种是安全的，用 HVT和 SB-1 接种鸟也可以预防 MD，但通常对 vv 和 vv+菌株的效果较差。通常在孵化后或卵内施用 MD 疫苗以允许雏鸡在成年鸡群中暴露于病毒之前被免疫（该过程需要 7 至 14 天以后获得完全保护）。目前疫苗接种策略的一个主要缺陷是它们不产生无菌免疫，即在接种疫

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UTR）中发现的部分互补序列的相互作用来调节转录后的基因表达。目前，miRBase 中了在 223 种物种中发现的超过 35,000 种 miRNA，其中在人类中发现了大约 2500 种 m（miRBase，版本 21）。每个 miRNA 被预测调节许多靶标，通常每个 miRNA 有超过个可能的靶标[27]；另一方面，一个基因可能受多个 miRNA 的调控，为 miRNA 基因调络增加了另外一层复杂性。miRNA 可以源自多种 RNA 分子，其可以以不同方式调节录，但是通过保守途径加工以形成成熟的 miRNA。内含子 miRNA 是从那些已知基因含子序列中产生的，而基因间 miRNA 是从基因间区域产生的。较长的初始 miRNA 初录物（pri-miRNA）由 RNA 聚合酶 II 和 III 直接从基因组 DNA 产生。转录后，每个miRNA 形成茎环结构或发夹，其由 RNA 酶 III 酶 Drosha 进一步加工以产生前体 m（pre-miRNA）。然后，Exportin-5 将 pre-miRNA 从细胞核转运到细胞质。在这里，，它另一种酶 RNA III 酶加工，Dicer 和 Argonaute 蛋白（人类中的 AGO1-AGO4）结合并RNA 诱导的沉默复合物（RISC）。解链后，一条 miRNA 链被降解，剩下的一条成为的 miRNA[28-30]。miRNA 通常通过与其靶 mRNA 转录物的 3'-UTR 序列发生不完全或完碱基互补配对来调节 mRNA 靶标。miRNA 和靶标结合的杂交效率由种子序列决定miRNA 5'-末端内覆盖 2-7 个核苷酸的一段 6 个核苷酸[31]。如图 1-2 所示，miRNA 通过mRNA 的 3’端非编码区（3’UTR）相互作用或影响 mRNA 的翻译，在转录后水平发挥调控作用，在多种疾病中发挥生物学功能[32]。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31

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