PRRSV核衣壳蛋白抑制IFN-β产生的机制研究

发布时间：2020-05-07 13:43

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又被称为蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的一种危害养猪业的病毒性传染病,主要引起母猪的繁殖障碍、公猪的精液品质下降、初生仔猪的死亡以及其它年龄猪的呼吸系统疾病。天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,但在与宿主的共进化过程中,病毒往往会发展各种机制抵抗宿主的天然免疫,达到成功感染的目的。以前的研究表明,PRRSV感染能够拮抗I型干扰素(Interferons,IFNs)的产生,而且PRRSV编码的多种蛋白,包括非结构蛋白nsp1,nsp2,nsp4,nsp11和结构蛋白N蛋白,具有拮抗干扰素产生的能力,但其分子机制尚不完全清楚。N蛋白是PRRSV编码的核衣壳蛋白,也是PRRSV的主要结构蛋白,在PRRSV的感染、致病和免疫调节中扮演着十分重要的作用。本研究针对PRRSV N蛋白,探讨其拮抗IFN-β产生的分子机制,主要研究内容如下:1.超表达PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生和IRF3激活将PRRSV N蛋白的真核表达质粒转染HEK293T细胞,在仙台病毒(Se V)的刺激下,采用IFN-β启动子的双荧光素酶报告系统检测IFN-β的产生,发现超表达PRRSV N蛋白显著抑制IFN-β的启动子激活。IRF3是干扰素信号通路中最关键的转录因子,我们采用同样的策略分析了N蛋白对IRF3的影响,发现超表达N蛋白也显著抑制IRF3激活,并且呈剂量依赖性。2.PRRSV N蛋白作用于RIG-I/MDA5信号通路的靶点分析RIG-I/MDA5信号通路在RNA病毒激活干扰素产生中具有十分重要的作用。为了研究PRRSV N蛋白是否拮抗RIG-I/MDA5信号通路以及其作用的靶点,通过共转染PRRSV N蛋白的真核表达质粒和RIG-I/MDA5通路中各受体分子(RIG-I、MDA5)、接头蛋白(IPS-1)、蛋白激酶(TBK-1、IKKε)和转录因子(IRF3)的真核表达质粒,利用双荧光素酶系统检测IFN-β的启动子活性。结果表明,PRRSV N蛋白可以拮抗RIG-I、MDA5、IPS-1、TBK-1、IKKε和IRF3介导的IFN-β启动子激活。更重要的是,PRRSV N蛋白还可以拮抗IRF3显性突变体IRF3-5D介导的IFN-β启动子激活,提示PRRSV作用RIG-I/MDA5通路的靶点在IRF3或IRF3下游。通过间接免疫荧光实验进一步分析了N蛋白的亚细胞定位,发现PRRSV N蛋白呈现细胞质和细胞核穿梭分布,表明其具有在细胞核内靶向IRF3的可能。3.PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生的关键功能域分析为了确定PRRSV N蛋白抑制IFN-β产生的关键结构域,通过IFN-β启动子的双荧光素酶报告系统,分别检测了N蛋白的不同区域缺失突变体(6个N-端缺失突变体和5个C-端缺失突变体)抑制IFN-β产生的能力。结果显示:PRRSV N蛋白的aa37-57和aa69-123是抑制Se V诱导的IFN-β激活的关键区域,而aa37-57正好包含N蛋白的核定位信号序列。
【图文】：

2图 1-2 PRRSV N 蛋白结构图解 (Music and Gagnon, 2010)Fig. 1-2 Schematic presentation of PRRSV nucleocapsid (N) proteinPRRSV N 蛋白的 C 端被认为是二聚体结构域 (Dimerization domain) (Spilm

图 1-1 PRRSV 基因组组成 (Castelo et al., 2015)Fig. 1-1 PRRSV genome organization1.2 PRRSV N 蛋白简介
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3

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本文编号：2653061