长角血蜱胚胎发育中组织蛋白酶D的变化及作用

发布时间：2020-05-07 18:59

【摘要】：蜱为一类专性吸血的体外寄生动物,寄生于哺乳类、鸟类、爬行类和两栖类,传播真菌、细菌、立克次氏体、病毒、螺旋体和等病原体,引起寄主多种疾病,如细菌性疾病、森林脑炎、Q热、出血热、蜱媒斑点热和莱姆病等。卵黄蛋白是一种血红素结合糖脂蛋白。在胚胎发育中作为营养源,通过程序性降解,提供卵发育所需的氨基酸、糖和脂类等,这一过程需要多种酶参与。有关酶与卵黄蛋白和胚胎发育的研究主要集中在昆虫,蜱类中仅在微小扇头蜱有报道。组织蛋白酶D属于天冬氨酸蛋白酶,是一种重要的酸性水解酶。组织蛋白酶D与卵黄蛋白间的关系在长角血蜱中尚未研究。本论文以长角血蜱为对象,运用DNA测序、qPCR技术、生物化学、分子生物学和统计学等方法,对其胚胎发育过程中组织蛋白酶D的变化及其在卵黄蛋白降解中的作用进行了研究。组织蛋白酶D表达量结果显示,胚胎发育1~9天表达量弱,第11天显著增加且达到峰值,11天后逐渐下降。酶活性结果显示,组织蛋白酶D在胚胎发育整个阶段均有活性,1~5天呈下降趋势,7~13天急剧上升,13天最高,13~17天逐渐下降。干扰饱血和饥饿雌蜱中组织蛋白酶D基因,饱血雌蜱产卵量(0.13 g)与对照组无明显差异,卵的孵化率(57.22%)与对照组(88.53%)差异显著,表明在饱血期干扰组织蛋白酶D基因可影响卵的孵化。饥饿雌蜱产卵量(0.09 g)与对照组无显著差异,孵化率(65.38%)与对照组(84.97%)有明显差异,说明在饥饿期干扰组织蛋白酶D基因影响卵的孵化。提取13天卵粗提物与不同浓度组织蛋白酶D和组织蛋白酶D抑制剂PepstainA孵育,结果表明组织蛋白酶D对卵黄蛋白降解有作用且呈现剂量关系。1 U的组织蛋白酶D对卵黄蛋白降解无影响,3 U对卵黄蛋白降解有影响,6 U时卵黄蛋白几乎全部被降解。与组织蛋白酶D抑制剂孵育后,卵黄蛋白降解受到抑制,说明组织蛋白酶D参与卵黄蛋白降解。上述研究结果为深入阐明蜱类胚胎发育中酶的调控提供依据。
【图文】：

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94℃ 60 s55℃ 30 s94℃ 30 s溶解曲线需要验证 PCR 产物的特异性。样品进行 6 次生分析与处理量 PCR 的处理结果采用 2ΔΔCt方法进行计算。计算实均 Ct 值；由实验组与对照组 Ct 值减去对应内参基因 β验组 ΔCt 值减去对照组 ΔCt 值得到 ΔΔCt 值。验结果蛋白酶 D 基因片段的扩增er Premier 5.0 软件设计长角血蜱组织蛋白酶 D 的特异性引到一个与预期片段大小一致的 165 bp 的扩增条带，扩增

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图 2-2 组织蛋白酶 D 定量基因的菌落 PCR 扩增电泳图M：DNA 标准分子量；1-10：特异性扩增片段Fig. 2-2. Colony PCR amplification electropherogram of cathepsin D quantitative geneM: DNA Marker; 1-10: Fragment of cathepsin D by specific amplification2.3.3 组织蛋白酶 D 定量基因测序结果比对用 DNAMAN 软件将测序结果与已上传的组织蛋白酶 D 的基因序列进行比对，两者碱基的相似度为 99.38 ％，蛋白序列并无差异，表明设计的组织蛋白酶 D 定量引物正确，，碱基序列比对结果见图 2-3：
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.746

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