鲜肉源沙门氏菌优势血清型的基因分型与喹诺酮类耐药性及其基因的研究

发布时间：2020-05-07 21:00

【摘要】：沙门氏菌(Salmonella)是引起食源性疾病的首要因素,被全世界认为是首选控制的食源性致病菌之一。人和动物感染Salmonella后可引起严重的胃肠炎导致食物中毒,感染严重者还能导致其死亡,是危害人类健康的重大隐患,造成了巨大的经济损失。由于Salmonella表型特征并不稳定,因此利用表型分型所能获得的菌株之间的相关信息并不详尽,无法鉴别生化特性、血清型相同的不同Salmonella菌株。为了能够更好地对Salmonella进行流行病学调查和溯源,更快地应对食品安全的紧急情况,具有高通量、灵敏度高、重复性好、便于推广等优点的分子分型技术将成为必需的技术。本课题利用两种基因分型技术分别对广西地区市售生鲜肉源的Salmonella优势血清型分离株进行基因分型,目的是寻找一种能够对食品污染的Salmonella进行快速溯源的分子技术。同时对近年来广西生鲜肉源Salmonella的喹诺酮类药物的耐药现状进行研究。本课题选取实验室保存的2011-2016年从广西部分地区超市及自由市场售卖的生鲜鸡肉、鸭肉、猪肉、牛肉中分离的Salmonella两个优势血清型S.derby和S.agona之71株和21株进行基于肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)的聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)的分析,并根据分离株的年份、地域及ERIC-PCR基因型选取13个代表菌株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)的分析。结果 92 株Salmonella分离株的ERIC-PCR的指纹图谱均在250bp处得到沙门菌属的特异性扩增条带;71株S.derby指纹图谱的相似系数在0.74～1.00之间,可分为6个基因型,其中Ⅰ和Ⅲ型为优势基因型,分别占了 54.93%(39/71)和 19.72%(14/71);21 株S.agona指纹图谱的相似系数在0.68～1.00之间,可分为6个基因型,其中基因型A(28.57%,6/21)和B(33.33%,7/21)为优势基因型;进一步研究发现,同一市场里不同种类的肉品存在同一Salmonella的污染、同一市场里同种类的肉品存在不同的Salmonella的污染、同一市场里不同采样时间的同种类肉品存在同一Salmonella的污染等情况;MLST基因分型的研究结果表明,7株S.derby均为ST40(19-20-3-20-5-22-22)、6 株 S.agona 均为 ST13(3-3-7-4-3-3-7)。本课题还对71株S.derby进行包括萘啶酸、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、加替沙星5种常用喹诺酮类抗生素耐药性研究。首先,通过常规药敏纸片(K-B)法对菌株进行耐药表型的检测,然后对质粒介导的喹诺酮类耐药(plasmid mediated quinolone resistance,PMQR)之 qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-lb-cr、oqxA、oqxB、qepA共7种基因分别进行PCR检测,并对gyrA和parC基因的喹诺酮类耐药决定区进行测序并分析其氨基酸位点突变情况,最后将耐药表型与耐药基因进行关联分析。结果显示,71株受试S.derby对第一代的喹诺酮类药物萘啶酸之耐药性严重,耐药率为19.72%、不敏感率为43.66%;对第三代的环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星敏感(敏感率分别为71.83%、74.65%、70.42%),但其中介率也比较高(分别为23.94%、25.35%、25.35%);对第四代的加替沙星则最敏感(敏感率为84.51%),中介率为14.08%。有76.06%(54/71)的菌株检测到了 PMQR基因,其中oqxA检出率最高(53.52%)、oqxB检出率次之(49.30%)、qnr与aac(6')-Ib-cr的检出率相近,分别为 29.58%(21/71)、25.35%(18/71),qnrA与qnrB基因检出率较低,分别为4.23%(3/71)、5.63(4/71),未检测到qepA基因;携带2种PMQR基因菌株的的百分比最高,占菌株数的 32.39%(23/71),有 12.68%(9/71)、11.27%(8/71)的菌株分别携带3种、4种PMQR基因,oqxA和oqxB两种基因与对萘啶酸耐药的表型符合率较高,都达到了 70%以上,aac(6')-lb-cr和qnrS基因的符合率都在40%左右;14株对萘啶酸耐药的菌株中,有92.86%(13/14)的菌株在gyrA或parC两个基因共检测到21个氨基酸突变位点,其中gyrA的D87N和S83I两个位点突变分别有35.71%(5/14)和 21.43%(3/14),parC的主要位点突变为 T57S(42.86%,6/14)和 T57V(21.43%,3/14)。本课题研究结果证明,广西地区生鲜肉源Salmonella基因型呈现多样性,表明Salmonella的污染源广泛;ERIC-PCR分型技术可用于生鲜肉污染的Salmonella之溯源;Salmonella对喹诺酮类的耐药现象较严重,gyrA和parC基因的位点突变是Salmonella对喹诺酮类药物产生耐药的主要机制,而PMQR基因的携带也是Salmonella产生耐药的一个重要机制。
【图文】：

遗传关系,鲜肉,聚类树

逦ｆ逦ＩＩ逡逑图２－１邋７１株鲜肉源如分离株遗传关系聚类树状图逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅｔｉｃ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｏｆ邋７１邋５＊．邋ｄｅｒｂｙ邋ｉｓｏ

电泳图,管家基因,电泳图

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【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】