PCV2抑制病原相关分子模式诱导猪肺泡巨噬细胞表达IL-12p40的分子机制

发布时间：2020-05-08 01:40

【摘要】：猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是猪圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原。临床发现PCV2感染的仔猪常伴随其他病原的共同感染,但PCV2感染动物对多种病原易感的免疫机制尚不清楚。作为一种重要的促炎性细胞因子,白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)在机体抵抗病原微生物感染的过程中发挥着至关重要的作用。IL-12p40在PCV2感染仔猪脾脏和淋巴结等器官中的表达能力显著下调,接种PCV2的仔猪肺泡巨噬细胞IL-12p40的表达能力亦降低。但PCV2感染仔猪后通过何种机制导致免疫器官中IL-12p40表达受到抑制,目前并不清楚。本试验拟将PCV1、PCV2的Rep、Cap蛋白互换,构建PCV1-Rep2、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV2-Cap1四种突变毒株,将其分别转染PK-15细胞后,连续传代5次,获得4株PCV突变毒株,为后续研究提供材料。之后检测Mock、PCV1和PCV2感染的猪肺泡巨噬细胞中LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导IL-12p40表达的水平,再通过表达PCV2 Rep和Cap的重组腺病毒以及PCV突变毒株感染猪肺泡巨噬细胞,明确PCV2抑制IL-12p40表达的关键组分,确定参与PCV2感染抑制细胞中IL-12p40表达的关键信号通路和miRNAs,明确PCV2感染抑制病原相关分子模式诱导猪肺泡巨噬细胞IL-12p40表达的分子机制,为进一步阐明PCV2感染导致的免疫抑制机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.通过嵌合载体构建方法,将PCV1的Rep1和Cap1分别替换为PCV2的Rep2和Cap2;将PCV2的Rep2和Cap2分别替换为PCV1的Rep1和Cap1,成功构建了PCV1-Rep2、PCV2-Cap1、PCV1-Cap2和PCV2-Rep1四种PCV的突变毒株。2.分别用Mock、PCV1、PCV2体内或体外感染猪肺泡巨噬细胞后,LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激细胞,ELISA和Q-PCR检测IL-12p40表达水平,结果显示,与Mock或PCV1感染组相比,PCV2体内或体外感染猪肺泡巨噬细胞能显著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40表达。3.分别用表达PCV2 Rep、Cap的重组腺病毒rAd-Rep、rAd-Cap感染猪肺泡巨噬细胞,再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激猪肺泡巨噬细胞,结果显示,Rep和Cap在细胞水平均可显著抑制由LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40表达,但相对于Rep,Cap蛋白抑制作用更显著;同时,以PCV或PCV突变毒株感染猪肺泡巨噬细胞,结果显示突变体PCV1-Cap2和PCV2-Rep1感染后显著抑制了由LPS/IFN-γ和LPS/R848诱导的IL-12p40表达。此结果说明,相对于Rep蛋白,PCV2的Cap蛋白更强烈地抑制IL-12p40表达。4.PCV2分别感染野生型(gC1qR~(+/+))和gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))猪肺泡巨噬细胞,Mock组显示gC1qR基因缺失未影响LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40的表达。PCV2感染gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))猪肺泡巨噬细胞,LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40的表达未被显著抑制,表明gC1qR参与PCV2抑制IL-12p40产生的过程。5.分别用Akt1、p38 MAPK和ERK1特异性siRNA转染细胞,感染PCV2后再以LPS/IFN-γ或LPS/R848刺激,结果显示,在转染Akt1和p38 MAPK特异性siRNA的细胞中,PCV2对IL-12p40的抑制作用被显著降低,而转染ERK1特异性siRNA的细胞中,IL-12p40的表达未见显著变化。6.PCV2感染的猪肺泡巨噬细胞,Q-PCR检测可能参与调控猪IL-12p40表达的mi RNA,结果显示在PCV2感染的PAMs中,miR-23a、miR-23b、miR-29a和miR-29b显著上调。重组腺病毒rAd-Cap可以上调这些miRNA表达,而rAd-Rep不能,同时gC1qR基因敲除(gC1qR~(-/-))的猪肺泡巨噬细胞中这些miRNA的上调被抑制,抑制Akt1的细胞中PCV2诱导的miR-23a、mi R-23b和miR-29b的表达被抑制,抑制p38 MAPK的细胞中PCV2诱导的miR-29a和mi R-29b的表达被抑制,此外,抑制ERK1对PCV2诱导的mi R-23a、mi R-23b、miR-29a和miR-29b上调无显著影响。7.分别用mi R-23a、miR-23b、mi R-29a和miR-29b的mimics或特异性抑制剂处理细胞,PCV2感染后用LPS/IFN-γ刺激,ELISA检测IL-12p40的分泌,结果显示,mimics预处理细胞后,LPS/IFN-γ或LPS/R848诱导的IL-12p40在蛋白水平均显著降低,然而,与对照组相比,只有miR-29a和miR-29b mimics能显著降低IL-12p40的mRNA水平;抑制mi R-23a和miR-29b可以显著逆转PCV2对IL-12p40在蛋白水平的抑制,抑制mi R-29b的表达能显著增加细胞中IL-12p40 mRNA水平,同时,与单独抑制miR-23a或miR-29b相比,同时抑制miR-23a和miR-29b或同时抑制4种miRNA(miR-23a、mi R-23b、miR-29a和miR-29b)能更显著地增加PCV2感染的PAMs中LPS/IFN-γ诱导的IL-12p40表达,但二者之间无显著差异。综上所述,本研究工作获得了4个PCV突变毒株PCV1-Rep2、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV2-Cap1。明确了PCV2通过其Cap与宿主gC1qR相互作用激活的Akt1和p38 MAPK信号通路上调mi R-23a和miR-29b表达,进而在转录和转录后水平抑制病原相关分子模式诱导的猪肺泡巨噬细胞IL-12p40表达。这些发现将对深入认识PCV2的免疫抑制机制具有重大意义。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

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本文编号：2653896