牛精源性miR-183对早期胚胎发育的影响

发布时间：2020-05-08 03:31

【摘要】：miRNA是一类内源性且具有调控功能的小分子非编码RNA,可以与靶基因3’非翻译区进行碱基配对结合来降解mRNA或者抑制其翻译。研究发现精子中的RNAs,尤其是miRNAs、tsRNA、以及siRNAs对合子基因的转换、表观重编程、受精胚胎发育以及其后代表型等都有着重要的影响。本研究根据本课题组前期构建的牛成熟精子、MII期卵母细胞和牛成纤维细胞的miRNAs文库,结合相关文献和生物信息学分析,初步筛选出精子高表达的miR-183,预测其可能是对早期胚胎发育起重要作用的一个miRNA。通过单细胞q-PCR方法精确验证miR-183在精子中高表达。对miR-183的靶基因进行生物信息学方法分析,并通过双荧光素酶实验和q-PCR确定了其在细胞骨架调控和凋亡通路上的靶基因:EZRIN、PPP2CA和PDCD6。将miR-183 inhibitor mimic、control mimic通过显微注射的方法注入受精卵原核期胚胎,发现miR-183 inhibitor组原核期纺锤体正常率较对照组显著降低(57.10%vs 76.07%,P0.05),且囊胚率、囊胚细胞数显著低于对照组(30.33%vs 37.33%;106.6 vs 115.2,P0.05)。对注射后体外受精各时期胚胎进行q-PCR,发现从原核期一直到4-细胞期,miR-183 inhibitor组的EZRIN、PPP2CA、PDCD6的基因表达水平显高于NC组,证明了miR-183对靶基因的调控作用持续到4-细胞时期;对各组囊胚凋亡率进行分析,发现miR-183 inhibitor组的囊胚凋亡率显著高于对照组(8.2%vs 4.8%,P0.05)。综上所述,通过生物信息学方法结合分子水平上验证,找到miR-183在受精后胚胎中的靶基因:EZRIN、PPP2CA、PDCD6。通过功能缺失实验发现miR-183对受精后胚胎的纺锤体形成、囊胚发育及胚胎质量具有显著影响。
【图文】：

使用前漩涡重悬磁珠，样品加入 40 μL动 10 min 使其均匀混合，磁铁架吸附分离磁性 0 μL 的 80%乙醇，，漩涡仪均匀混合，继续用磁铁in，加入 20 μL 的 EB 缓冲液，1100 rpm 5 min，分加入 9 μL 预扩增试剂，进行预扩增程序，预扩增7℃孵育 30 min，95℃孵育 5 min，加入 100 μL 水反应。引物设计iRBase 网站上找到 bta-miR-183 的成熟序列。序列所有的 U 改为 T，碱基替换后的序列就是 b在 IVF 胚胎中的表达

靶基因报告载体为模板，经过重叠延伸PCR构建psi-mut-EZRIN、psi-mut-t-PPP2CA 靶基因突变载体。图 4-1 所示，1-4 是突变 PPP2CA 结合位点的-8 是突变 EZRIN 结合位点的 3’UTR 序列；9-11 是突变 PDCD6 结合位点的测序结果正确，靶基因 EZRIN、PDCD6、PPP2CA 的突变载体构建成功图 4-1 PCR 扩增靶基因突变序列Fig 4-1 PCR amplication of the the target gene mutant sequenceLR 检测结果
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】

相关硕士学位论文 前2条

1 童彬彬;Ezrin对小鼠卵母细胞体外成熟的影响[D];安徽农业大学;2015年

2 唐超;Ppp2ca基因的失活对雄性小鼠精子发生的影响及海马中特异性敲除Dicer1蛋白的小鼠的构建和表型[D];南京医科大学;2013年

本文编号：2654044