杆状病毒表达系统融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白与口蹄疫病毒VP1蛋白及其免疫原性的研究

发布时间：2020-05-08 07:35

【摘要】：猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是一种猪源性疾病,可以破坏5~12周龄仔猪的免疫系统,使其相继因营养缺失或多种并发症而导致死亡。猪等偶蹄目动物在自然状态下感染口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)后,经常表现出的病理状态为唇、蹄部皮肤发生糜烂并多伴有大量水泡生成,使其进食困难,阻碍其生长。目前这两种疾病都对我国的养猪业造成了巨大的危害,现如今对猪进行疫苗免疫是我国普遍通用的预防手段。但是,针对这两种动物疫病的传统疫苗仍存在很多不足和需要改进的方面,因此仍需依靠基因工程等方法研制出新型的动物疫苗来控制这两种疾病的传播。PCV2 Cap蛋白是PCV2的主要结构性蛋白,能介导病毒的识别和入侵,这种分布在病毒表面的蛋白质与病毒的病原性息息相关。而VP1蛋白是FMDV的主要结构性蛋白,这种蛋白对FMDV的血清型差异以及免疫原性的隔离都有着关键性的影响,同时能够被宿主细胞表面的受体识别并与之结合。因此,Cap和VP1通常被作为针对PCV2和FMDV基因工程疫苗的关键性靶蛋白。目前,已有多篇研究表明CD40配体(CD40 Ligand,CD40L)可以作为分子佐剂增强疫苗的免疫效果。因此,猪CD40L可以成为增强这两种疾病疫苗的分子佐剂,提高其免疫效果。本研究将Cap和VP1这两种蛋白与猪CD40L进行融合表达并利用杆状病毒表达系统,将融合蛋白展示在杆状病毒表面,构建了3种重组杆状病毒:rvAc-Cap、rvAc-VP1和rvAc-Cap-VP1。通过SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测这3种重组杆状病毒感染的sf9细胞证明3种融合蛋白成功表达,大小分别约为146 kDa、138 kDa和165 kDa,符合预期理论值。并通过间接免疫荧光和免疫电镜验证了融合蛋白成功展示在了被感染细胞的细胞膜表面和重组杆状病毒的囊膜表面。以1×10~8 pfu/只的剂量用纯化的重组杆状病毒颗粒作为活载体疫苗对BALB/c小鼠进行皮下免疫接种,通过间接ELISA检测小鼠血清中Cap和VP1的抗体浓度,证明表面展示有Cap和VP1的重组杆状病毒能激发小鼠产生较高的抗体水平,与PCV2和FMDV商品化疫苗免疫组的抗体浓度差异不显著(P0.05),检测小鼠血清中IL-4的浓度,证明重组杆状病毒能够刺激小鼠的IL-4分泌水平升高。为了进一步探究其免疫效果,将rvAc-Cap-VP1以1×10~8 pfu/只的剂量通过雾化免疫的方法免疫小鼠,间接ELISA检测表明小鼠血清中Cap和VP1的抗体浓度与PBS组相比显著升高(P0.05),rvAc-Cap-VP1雾化免疫组的IL-4分泌水平升高。上述实验结果表明,表面展示有Cap蛋白和VP1蛋白的rvAc-Cap-VP1重组杆状病毒通过皮下注射免疫和雾化免疫均能够激发小鼠产生PCV2和FMDV的体液免疫应答以及细胞免疫应答,拥有良好的免疫原性。本研究将Cap和VP1展示在杆状病毒表面,并初步探索了rvAc-Cap-VP1重组杆状病毒在小鼠机体上的免疫效果,为进一步研制和生产PCV2、FMDV二联活载体疫苗建立了良好的理论基础。
【图文】：

猪圆环病毒,衣壳蛋白

床《局刈楸泶?PCV2 Cap 与 FMDV VP1 蛋白及免疫研究2图1.1 猪圆环病毒2型的衣壳蛋白结构[14]Fig. 1.1 Structure of the Capsids of PCV2根据分子流行病学的分析显示，ORF2相对于ORF1和ORF3等其他的基因来说，具有更高的可变异性，并且ORF2的多变性与病毒的毒力和病毒复制也有着重要的关系。PCV2可通过Cap蛋白与病毒结合受体肝素硫酸盐和软骨素硫酸盐B黏多糖的相互作用来介导病毒侵入宿主体内[15]。因此，基于ORF2的多态性，在PCV2的ORF2区域内具有特定的等位基因。PCV2毒力决定因子的研究结果也表明，PCV2的Cap蛋白中氨基酸的置换会增强PCV2在体外的增殖能力，但是病毒的毒力和侵染细胞的能力会大大降低[16, 17]。作为PCV2主要的免疫原性蛋白

口蹄疫病毒,衣壳蛋白,二十面体,结构示意图

2.1 FMDV 的结构蛋白质及功能经过病毒结构解析后发现，，FMDV的病毒粒子在空间上呈规则的球形，如图1.2[28]所示，病毒表面的衣壳由60个不对称的原体紧密包裹而成，结构蛋白在病毒表面形成一个规则对称的二十面体形状。图1.2 口蹄疫病毒的二十面体衣壳蛋白结构示意图[28]Fig. 1.2 Schematic depiction of the FMDV icosahedral capsid通过对比不同血清型的FMDV结构，发现结构蛋白中存在差异的构象主要集中在VP1~ 3的环状区域和羧基端，而这些导致不同血清型差异化的结构全都暴露在病毒衣壳的外表面[29]。
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】