禽呼肠孤病毒p10蛋白在宿主细胞中降解的分子机理研究

发布时间：2020-05-09 06:08

【摘要】：禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)是一种重要的禽类病原,在临床上引起多种病型,譬如病毒性关节炎、慢性呼吸道疾病、生长迟缓和吸收不良综合征,而且ARV感染会造成家禽的免疫抑制,加剧其它病原感染的风险,给家禽养殖造成重大经济损失。p10是由ARVS1基因编码的非结构蛋白,属于I型跨膜蛋白,是ARV重要的毒力因子。其主要作用是在细胞膜上穿孔,破坏宿主细胞的细胞膜,促使细胞融合进而有利于病毒扩散,是引起合胞体形成的主要因素。然而,该蛋白在宿主细胞内会被迅速降解。我们之前的研究发现,ARVp10在细胞内与溶酶体膜相关蛋白-1(Lysosome Associated Membrane Protein-1,LAMP-1)发生相互作用,并通过蛋白酶体途径降解,而且LAMP-1在p10降解中发挥重要作用,然而LAMP-1如何在p10降解中发挥作用以及p10降解的分子机制尚不十分清楚。本研究利用免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜检测技术,证实ARV p10和E3泛素连接酶Siah-1发生相互作用,进一步通过分子生物学以及免疫沉淀检测技术,确定p10的N端胞外区(1aa～43aa)和Siah-1的C端底物结合区(141aa～282aa)相结合。在DF-1细胞中,过表达Siah-1可以促进p10的降解,并且这种降解作用能被蛋白酶体抑制剂MG132抑制,说明p10降解依赖于泛素化蛋白酶体途径。利用RNAi技术沉默内源Siah-1表达,使p10的表达量明显提高。过表达Siah-1则促进p10的泛素化水平,相反RNAi干扰Siah-1表达明显抑制p10的泛素化,该结果证明Siah-1促使p10泛素化。同时通过体外泛素化实验也证明Siah-1促使p10泛素化。此外,在DF-1细胞中过表达Siah-1或以RNAi沉默Siah-1表达后感染ARV,检测病毒复制情况,结果发现过表达Siah-1明显抑制病毒增殖,相反干扰Siah-1的表达会使病毒增殖显著增强,并且细胞形成合胞体的数量也显著提高,说明Siah-1在ARV增殖中发挥重要作用。在ARV感染的情况下,以p10单抗与细胞裂解物作免疫沉淀,结果表明p10单抗可以将p10蛋白、Siah-1以及LAMP-1同时沉淀下来,说明p10同时与Siah-1和LAMP-1相互作用,三者形成复合物。如果以RNAi干扰细胞内源性LAMP-1表达,p10与Siah-1的免疫共沉淀的量明显减少,而且p10与Siah-1共定位的量也随之减少,同时Siah-I促进p1 0降解的能力也下降。该结果表明在ARV感染情况下,Siah-1通过与LAMP-1以及p10形成复合物引起p10泛素化,从而使p10通过蛋白酶体途径降解。综上所述,本研究发现宿主细胞感染ARV后,E3泛素连接酶Siah-1通过泛素化ARV p10蛋白使其降解,抑制病毒增殖。在此过程中,LAMP-1招募Siah-1以及p10形成复合物,促进Siah-1与p10结合,起到桥梁的作用,进而使p10泛素化并通过蛋白酶体途径降解,抑制ARV增殖。该研究结果揭示了 Siah-1在LAMP-1促进p10降解中起关键作用,为进一步研究ARV感染的致病机理提供重要参考。
【图文】：

图２－１邋ＰＣＲ扩增}0／？－／基因逡逑Ｍ：分子量标准，？邋１：邋Ｓ／Ｍ－／ＰＣＲ产物．？邋２：阴性对照逡逑

图２－２邋ＤＦ－１细胞中转染表达的Ｓｉａｈ－１融合蛋白的表达检测逡逑Ａ：邋ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ或ｐＣＭＶ－Ｍｙｃ－Ｓｉａｈ－１邋转染ＤＦ－丨细胞３６邋ｈ后，，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测蛋白表达：逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 黄新敏;张艳霞;万小荣;;泛素蛋白的研究进展[J];广东农业科学;2010年06期

2 郭纯;;免疫共沉淀技术的研究进展[J];中医药导报;2007年12期

3 刘文兴;禽呼肠弧病毒感染[J];畜牧兽医科技信息;2003年09期

4 吴宝成,陈家祥,姚金水,陈枝华,陈文列,李国平,曾显成;番鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J];福建农业大学学报;2001年02期

相关博士学位论文 前3条

1 吴海洋;禽呼肠孤病毒p10蛋白诱导宿主细胞凋亡及自身降解的分子机理[D];中国农业大学;2016年

2 张志强;禽呼肠孤病毒Sigma-C蛋白引起宿主细胞凋亡的分子机理研究[D];中国农业大学;2015年

3 吴异健;两种中药多糖对呼肠孤病毒感染番鸭的免疫调节作用[D];福建农林大学;2010年

相关硕士学位论文 前8条

1 刘致永;P21~(WAF1/CIP1)泛素化介导结肠癌细胞HCT-116化疗敏感性的研究[D];南昌大学医学院;2015年

2 毕庄莉;新型鸭呼肠孤病毒σC基因在昆虫细胞中的表达及其免疫原性的初步研究[D];安徽农业大学;2014年

3 杨旭;鸭源呼肠孤病毒荧光定量RT-PCR方法的建立与应用[D];华中农业大学;2011年

4 孙雅萍;呼肠孤病毒番鸭不同分离株部分基因重组子代病毒与致病性的研究[D];福建农林大学;2009年

5 祁海波;禽呼肠孤病毒M组基因的克隆与序列分析[D];内蒙古农业大学;2008年

6 邹志华;锯缘青蟹性别分化和性腺发育的EST及基因芯片初步分析[D];集美大学;2008年

7 陈元坤;鸡病毒性关节炎病毒增殖特性与间接ELISA抗体检测方法的建立研究[D];四川农业大学;2007年

8 刘文兴;中国禽呼肠孤病毒番鸭分离株的纯化及其核酸与结构蛋白分析[D];福建农林大学;2005年

本文编号：2655710