黄体期短期优饲对绵羊卵泡发育影响及其调控机理

发布时间：2020-05-10 08:11

【摘要】：本文旨在研究黄体期短期优饲对绵羊卵泡发育的影响及其调控机理。通过短期优饲对血浆和卵泡液中代谢信号物质、生殖激素浓度、血浆脂质代谢及卵泡颗粒细胞生殖相关基因表达影响,探讨短期优饲促卵泡发育的作用机理,并通过下丘脑-垂体-卵巢轴系转录组分析,揭示短期优饲影响卵泡发育的分子调控网络,为研究营养调控绵羊繁殖提供理论依据。试验包含4部分内容:1绵羊黄体期短期优饲时间的确定试验选取60只9-10月龄、体重40 kg左右的道寒杂交(道赛特公羊×小尾寒羊母羊)一代母羊,随机分为四组,15只/组。对照组试验期间饲喂基础日粮(DE 11.72 MJ/d,DP 79.71 g/d),试验组先饲喂基础日粮,在优饲期间饲喂试验日粮(DE 18.75 MJ/d,DP 108.44 g/d),优饲结束后恢复基础日粮。所有试验用羊进行同期发情处理(阴道埋置CIDR 12 d,肌注PG 0.1 mg两次),以埋栓日为第0 d,试验组于埋栓的第2 d、6d、8 d分别饲喂试验日粮,优饲期分别为10 d、6 d、4 d,于埋栓第12 d优饲结束撤栓注射PG,于埋栓后第20 d,选择发情结束的羊,利用腹腔镜来检测黄体个数。记录补饲前、补饲后体重变化及排卵率,确定促排的最佳优饲时间。结果表明:试验组平均体重增加但无显著差异(P0.05);与对照组相比,优饲10 d、6 d、4 d排卵率分别提高了75%,25%,0%。由此确定,发情前10 d进行短期优饲,可作为后续优饲试验方案进行。2黄体期短期优饲对绵羊卵泡发育及血浆相关指标的影响选择60只体重40 kg左右的道寒杂交羊,随机分为试验组和对照组,每组30只。按短期优饲10 d方案进行。优饲第1、2、4、6、8、10 d每组随机选取5只羊,空腹颈静脉采血,收集血浆,备测生殖激素、代谢激素、脂质代谢。于埋栓后第13 d,14d,15 d,每组随机选取6只羊屠宰,取卵巢组织,按小卵泡(≤3.0 mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)分别收集卵泡液及颗粒细胞,备测生殖激素、代谢激素及基因的表达。结果表明:短期优饲组小卵泡(3.0 mm)数量极显著低于对照组;中等卵泡(3.0-5.0 mm)数量呈极显著上升;大卵泡(≥5.0 mm)数量在卵泡期后期呈极显著上升。中等卵泡和大卵泡中葡萄糖、胰岛素含量极显著升高,瘦素含量只在大卵泡中显著升高。而小卵泡液中FSH含量显著增加,LH含量大卵泡中极显著的增加,雌二醇(E_2)浓度在大卵泡中极显著的高于小卵泡、中等卵泡。血浆中葡萄糖、胰岛素和瘦素浓度显著升高,生殖激素在短期优饲期间,FSH、LH和雌激素平均水平差异不显著。血浆中胆固醇、游离脂肪酸浓度全期显著下降,高密度脂蛋白胆固醇浓度极显著增加,尿素氮浓度显著下降。表明黄体期短期优饲,有利于促进体内能量的正平衡,提高葡萄糖、胰岛素和瘦素的利用率和进入率,促进卵泡颗粒细胞的增殖分化速度。3黄体期短期优饲对绵羊卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响取埋栓后第13 d,14 d,15 d屠宰的6只发情羊卵巢上分离得到小卵泡(≤3.0mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)的颗粒细胞进行qRT-PCR检测。结果表明:黄体期短期优饲促进卵巢FSHR1和FSHR3 mRNA基因在小卵泡和中等卵泡中的极显著表达,各级卵泡中CYP17A1mRNA基因表达显著高表达(P0.01),STAR和CYP19A1 mRNA基因在大卵泡中高表达(P0.01),同时LHR和ESR1的表达量极显著增加。中等卵泡和大卵泡中OB-R和IGF-1 mRNA基因在颗粒细胞中的表达极显著增加。表明黄体期短期优饲可通过调控颗粒细胞中FSHR不同剪接及类固醇调节基因的表达,且卵泡内旁分泌或自分泌因子基因的表达,从而调控卵泡发育。4黄体期短期优饲对绵羊下丘脑-垂体-卵巢轴系转录组分析于埋栓后第13 d,14 d,15 d(即卵泡期前期、卵泡期中期、卵泡期后期)每组取3只发情羊的下丘脑(B)、垂体(P)、卵巢(O)组织,进行RNA-Seq测序。通过Illumina Hiseq 4000测序方法,分析发情初期、中期、末期对照组与试验组下丘脑、垂体、卵巢组织中差异表达基因,来探讨营养对下丘脑-垂体-卵巢轴系调控卵泡发育的作用机理。结果表明:共构建了18个RNA文库,总共获得33149868-57138286不等的reads,比对到参考基因组上29560138~52705150个reads,占总读数的89.17%~94.53%。共检测出54339个转录本,其中获得了19207个可匹配的表达基因,其中大于2000 bp的转录本占编码转录本的64.89%,为后续基因分析提供了充足的数据。卵泡期间,黄体期短期优饲可通过钙离子信号、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等信号通路在下丘脑-垂体-卵巢轴系水平上调控卵泡发育,使更多的卵泡优势化并发育成熟;通过下丘脑-垂体-卵巢性腺轴系对各组织3 d共同表达的差异基因分析,筛选出一些与繁殖相关的基因如AGRP、LEPR、PRL、RERG、AKR1D1、IGF1、NLRP14、PRR11、EGR1等基因被显著富集,所有差异表达的基因均可能作为繁殖的候选基因,参与营养调控卵泡发育过程。
【图文】：

内分泌,垂体,反馈环,下丘脑

波内不同卵泡对垂体分泌的 FSH 和 LH 反应性决定[14]。在最后的卵泡波中，FSH 浓度在达到峰值后第 2 d 下降至最低点，FSH 峰后浓度水平的快速下降与卵泡的选择时间一致[12]，FSH 浓度降低，使一些卵泡不能获得继续生长的支持，而一些卵泡可以继续生长，从而引起优势卵泡与从属卵泡发生分化，使优势卵泡发育至排卵卵泡。当卵泡选择时，FSH 浓度处于 FSH 波谷的最低点，当注射外源 FSH 时，能够延长反刍动物的优势卵泡选择[15]。卵泡选择的另一个表现就是对 LH 的反应能力的获得，当FSH 浓度迅速升高时，使一些卵泡具有了对 LH 反应能力，，即使在 FSH 较低浓度时仍可保持良好生长态势[16]。另一方面，卵泡一旦被选择，优势卵泡会显著增加雌激素和抑制素-A[17]的分泌，并通过负反馈下调 FSH 的分泌（图 1-1[18]），而其他卵泡所分泌的抑制素-B，可调控FSH 的下降速度，如果 FSH 下降速度过快，虽 LH 脉冲存在，仅有 50%的优势卵泡获得发育，且母羊的排卵率显著降低，若 FSH 逐渐下降而 LH 脉冲存在的条件下，绵羊全部排卵且排卵率在正常范围内[19]。因此，优势卵泡中雌激素和抑制素共同反馈作用于性腺轴系统，抑制 FSH 的分泌，卵泡也由对 FSH 敏感转变为对 LH 敏感，并发育成优势卵泡，此过程是卵泡选择优势化的重要环节。

模型图,卵泡发育,绵羊,卵泡

然而 VL KOVá（2014）报道，短期补饲羽扇豆，对 IGF-1 浓度显著降低雌激素浓度，显著增加 3-5 mm 卵泡的数量。Meza-Herrera（进行短期蛋白补饲，血浆中 IGF-1 浓度、黄体数量和卵巢激素影响不发情前补饲蛋氨酸可显著增加血浆中 IGF-1 浓度，同时增加产仔总数]。体外培养卵泡时，卵泡内注射 IGF-1，可促进从属卵泡转变成优势F-1 可提高依赖 FSH 的颗粒细胞分化，尤其是对 LH 受体的接受性[3加 2-脱氧葡萄糖（DOG）和 3-O-甲基葡萄糖（OMG）升高，来调控性，尤其提高葡萄糖的利用率[86]。养调控卵泡发育的信号系统上研究，葡萄糖浓度升高可促进 GnRH 的脉冲释放，缓解能量负平衡制作用[87]，同时血糖浓度升高，也会刺激胰岛素和瘦素分泌，进而增及瘦素的浓度[88]。胰岛素也可在下丘脑水平上显著增加 GnRH 基因可增强胰岛素作用[89]，促进 GnRH 的分泌，降低卵泡闭锁。而在能中 IGF-1 可调控卵泡分裂和卵泡生长[90]，因此，在绵羊营养促进卵泡萄糖-胰岛素系统、瘦素系统和 IGF 系统[91]（图 1-2）。
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S826

【参考文献】