Met调节奶牛乳腺上皮细胞脂肪合成、细胞增殖及自噬的分子机理

发布时间：2020-05-10 08:21

【摘要】：氨基酸作为重要的有机小分子参与各项生命活动,既可合成蛋白质、脂质,又是调节细胞生长与分化、增殖与自噬等细胞代谢的关键信号分子。氨基酸作为外源信号可以激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)等来调控细胞代谢。Na~+偶联中性氨基酸转运蛋白2(sodium-coupled neutral amino acid transporter 2,SNAT2)是溶质载体转运蛋白,可转运蛋氨酸(methionine,Met)、亮氨酸(leucine,Leu)等中性氨基酸进入细胞,并在奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中高表达,促进BMECs乳合成,但其具体机理尚不清楚。实验室前期研究发现,SNAT2可以介导Met参与调节BMECs乳合成,而在泌乳过程中,BMECs的乳合成与细胞增殖、自噬及凋亡均相关,但其具体机理有待进一步研究。本研究将拟揭示Met调节BMECs乳脂合成、细胞增殖及自噬的分子机理,为进一步研究Met在乳生产中的重要作用提供实验依据。本研究以组织块法培养的BMECs为研究对象,免疫荧光结合Western blotting来鉴定BMECs中角蛋白18(cytokeratin 18,CK18)与β-酪蛋白(β-casein)的表达,证明获得纯化、可泌乳的体外培养BMECs。向体外培养的BMECs分别添加0、0.3、0.6、0.9和1.2 mM的Met,BODIPY染色及甘油三酯(triglyceride,TG)检测发现,随着Met浓度的增加,BMECs中脂滴及TG含量逐渐增加,并且在Met浓度为0.6 mM时达到峰值,随后下降。结果表明Met以剂量依赖性方式促进乳脂肪合成;CASY细胞计数及流式细胞仪检测细胞数和细胞周期变化,发现随着Met浓度增加,细胞数及S期和G2/M期的细胞比例逐渐增加,并且在Met浓度为0.6 mM时达到峰值,随后降低。结果表明Met以剂量依赖性影响BMECs增殖及细胞周期;Western blotting检测相关蛋白表达变化,结果发现p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平显著增加,在Met浓度为0.6 mM时最高,随后逐渐下降。结果说明Met对mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号传导途径的激活也具有剂量依赖性,添加0.6 mM的Met为最适浓度,过量的Met可能具有细胞毒性。为了研究Met对BMECs自噬的影响,Western blotting检测SNAT2抑制后自噬标志蛋白LC3-I/II表达量的影响,并利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-II)变化。结果显示,SNAT2抑制时,p-mTOR表达量下降,LC3-II表达量增加,免疫荧光检测自噬斑点增多。添加自噬增强剂海藻糖(trehalose,Tre)和Met后,Met组同Met+Tre组比较,p-mTOR表达量增加,LC3-II表达量降低,自噬斑点减少;添加Tre和Met并抑制SNAT2时,p-mTOR表达量下降,LC3-II表达量增多,自噬斑点增多。以上结果表明Met通过SNAT2抑制自噬。SNAT2基因进行过表达和干扰表明SNAT2可以正向调节BMECs中甘油三脂的分泌和脂滴的形成,Western blotting检测结果表明SNAT2过表达可以上调p-mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的蛋白水平,而干扰SNAT2后,结果与过表达相反。表明SNAT2是mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的上游信号分子,并可正向调节乳脂肪合成和细胞增殖。为了研究Met调节SNAT2表达的分子机制,添加PI3K抑制剂-渥曼青霉素(Wortmannin,Wm)抑制PI3K信号通路的同时过表达SNAT2,Western blotting检测发现,PI3K抑制消除了SNAT2过表达对p-mTOR、SREBP-1c以及Cyclin D1的蛋白质水平的刺激。PI3K抑制实验表明,SNAT2激活mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号通路需要PI3K激活。添加0.6 mM的Met同时抑制SNAT2,结果表明SNAT2敲低显著抑制Met对p-PI3K、p-mTOR、SREBP-1c和Cyclin D1的蛋白质水平的上调作用。Western blotting结合qRT-PCR检测发现,0.6 mM Met处理显著增加BMECs中SNAT2的蛋白质水平和mRNA水平,免疫荧光检测发现0.6mM Met处理显著增加SNAT2的细胞质定位。这些数据表明,Met通过SNAT2-PI3K调节mTOR,SREBP-1c和Cyclin D1信号通路。综上所述,Met剂量依赖性调节mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1的表达,过量的Met对细胞具有毒性,Met通过SNAT2-PI3K途径调节mTOR、SREBP-1c、Cyclin D1信号通路,从而影响BMECs乳脂肪合成、细胞增殖与自噬。
【图文】：

1图 1-1 泌乳期的腺泡与腺泡上皮细胞结构图[3] Architecture diagram of lactating mammary alveolus and alveolar epithelial 的各种营养物质供腺泡的分泌细胞产生乳汁并将其分泌到腺泡腔中，这一泌；而乳汁汇集后由导管排出则称为排乳，乳汁的分泌和排乳合称为泌乳由腺泡的数目决定，腺泡多则泌乳能力强[4]。泌乳主要通过神经-激素途动及维持两过程。泌乳启动首先于妊娠后期合成酪蛋白和乳糖等成分，然大量分泌乳汁[5,6]。泌乳维持指的是在泌乳启动后较长的一段时间内仍持肪的合成代谢是牛奶的重要组成，主要由 95%甘油三酯（triglyceride，TG）、2%的甘油小于 0.5%的胆固醇以及少量的游离脂肪酸组成[8]。乳脂肪也是评估牛奶标，每 100 g 牛奶约含 3-4 g 的乳脂。牛奶中大于一半的脂肪酸（fatty ac酸（saturated fatty acid，SFA），每 100 g 牛奶约含 1.9 g，其中 60%左右牛奶中含量最高的单不饱和脂肪酸（mono-unsaturated fatty acid，MUFA）

3图 1-2 奶牛乳腺中脂肪酸合成代谢途径[14]Fig.1-2 Metabolic pathways of fatty acids synthesis in bovine mammary glan油三酯的合成酯是乳脂肪的主要组成成分，其合成场所为乳腺上皮细胞的内质网。来源摄取和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）去饱和的用后，生成脂酰辅酶 A 参与甘油三酯的合成，并与 3-磷酸甘油酯化。甘油二酰基甘油酰基转移酶 1（diglyceride acyltransferase，DGAT1）等酶调控先在甘油主链的 sn-1(3)进行脂肪酸酯化，再将其合成于 sn-2 处并脱去磷油二酯，，经 DGAT 催化生成甘油三酯[15]。滴的分泌Lipid droplet）是细胞内细胞器，用于以中性脂质如甘油三酯和甾醇酯的形肪最终以脂滴的形式分泌，其大小为 40 nm-100 μm 不等。脂滴是包含许多脂质单层构成的中性脂质核心，其中一些蛋白质可参与脂质代谢[16,17在内质网膜中合成中性脂质导致新脂滴的形成，其可形成为与部分内质网
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823

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本文编号：2657022