长非编码RNA SYISL对肌肉生长发育的影响及其分子机制研究

发布时间：2020-05-10 08:34

【摘要】：肌肉组织是动物机体的重要组成部分,肌肉生长速度和肌肉量是动物生产中重要的经济性状之一。肌肉生长发育是一个复杂的过程,受到多种转录因子、表观遗传等因素的调控,因此解析肌肉生长发育的调控网络具有重要的理论和应用价值。LncRNA是一类转录本长度超过200nt,没有蛋白编码能力的RNA,在多种生物学过程中具有重要的作用,尽管目前已发现了很多在肌肉组织中表达的lncRNA,但绝大多数lncRNA的功能和调控机制并不清楚。本实验室前期通过分析C2C12成肌细胞不同分化时期lncRNA的表达水平变化,发现了一个lncRNA-AK004418随着细胞分化表达水平持续升高;该lncRNA位于SYNPO2基因内含子,因此将其命名为SYISL(SYNPO2 intron sense-overlapping lncRNA)。本研究通过基因敲除小鼠模型研究和细胞实验,开展了lncRNA SYISL对肌肉生长发育的影响及其表观调控机制研究。具体研究结果如下:1.利用荧光定量PCR技术验证了SYISL基因随着C2C12细胞的分化表达水平显著增加,组织表达谱分析结果发现其在腿肌、背最长肌和舌等肌肉组织中高丰度表达。利用启动子双荧光报告载体试验和染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecitation,ChIP)发现了MyoD可影响SYISL基因表达,并且SYISL启动子-200bp到+200bp区域存在MyoD结合位点,表明SYISL基因是受MyoD调控的靶基因。2.利用CRISPR-Cas9技术制备了杂合型SYISL基因敲除小鼠,以此为基础进行杂交扩繁,获得了SYISL双等位基因敲除(SYISL KO)小鼠,发现WT小鼠和SYISL KO小鼠的体重和生长速度并无显著差异。但与WT小鼠相比,SYISL KO小鼠胫骨前肌、股四头肌和腓肠肌等肌肉重量和肌纤维密度显著增加,肌纤维面积减少。分离培养了SYISL KO小鼠和WT小鼠肌卫星细胞,检测了SYISL基因敲除对肌卫星细胞增殖能力和分化的影响,结果发现SYISL基因敲除可以显著减少肌卫星细胞增殖和融合能力,但可显著促进肌卫星细胞的分化。3.通过RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)和RNA pulldown实验发现SYISL可以与EZH2(Enhancer of Zeste Homology 2)蛋白结合;通过构建SYISL基因缺失片段进行RNA pulldown和超表达实验,发现SYISL全长转录本是其结合EZH2和发挥功能所必需的。ChIP和共转染实验结果发现SYISL可通过招募PRC2(Polycomb Repressive Complex 2)蛋白导致靶基因启动子区域组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27me3),从而抑制靶基因表达;其中促进细胞增殖主要是通过抑制细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21基因的表达,而抑制细胞分化则主要是通过降低MyoG、Myh4和MCK等肌细胞分化相关基因的表达。4.利用Chromatin isolation by RNA purification(ChIRP)技术发现SYISL可直接结合在靶基因MyoG、Myh4、MCK和p21基因的启动子区域;在分别来源于WT和SYISL KO小鼠肌卫星细胞中分别超表达EZH2,发现仅在WT肌卫星细胞中EZH2可以抑制下游靶基因表达,而在SYISL KO肌卫星细胞中无显著影响,表明SYISL基因是PRC2调节成肌过程所必需的。5.通过保守性分析发现在猪基因组中SYNPO2基因的第1内含子处存在一个lncRNA AK238214。利用RACE技术验证了该lncRNA全长1472bp。时空表达分析结果发现该lncRNA在猪肌肉中高表达,并随着肌卫星细胞的分化表达水平持续升高。核质定位结果发现AK238214主要位于猪肌卫星细胞的细胞核内。设计AK238214特异siRNA干扰片段进行慢病毒包装后转染猪肌卫星细胞,检测了猪肌卫星细胞增殖和分化能力,发现干扰AK238214可以抑制细胞增殖,促进猪肌卫星细胞的分化,这一结果与在小鼠中的研究结果一致。综上所述,本研究发现了lncRNA SYISL可通过与PRC2蛋白互作抑制肌细胞分化和降低肌肉重量,并在猪骨骼肌卫星细胞中验证了猪SYISL对肌细胞增殖与分化的影响。该研究结果为动物肌肉生长发育研究提供了新的调节因子和表观调控机制,对深入解析肌肉生长发育的分子调控网络具有重要意义。
【图文】：

调节因子,肌纤维,生肌节,肉质性状

长发育及调控生长发育骼肌主要附着于骨骼上，其通过肌纤维的收缩来完长发育是动物产肉性能和肉质性状的主要重要影响发育形成原肠胚，并形成外胚层、中胚层和内胚层（Chordamesoderm）、轴旁中胚层（Paraxial meso mesoderm）和侧中胚层（Lateral mesoderm）(Gilb发育，轴旁中胚层可分化形成生肌节，生肌节可形迁移到四肢和躯干部分，，同时，在系列因子或者细胞（Myoblasts）(Musumeci et al 2015)。成肌细胞后形成成熟的肌纤维 (图 1-1)。

模式图,祖细胞,模式图,肌卫星细胞

图 1-2 Pax3/Pax7 调节肌祖细胞模式图(BuckinghamandRigby 2014)Figure 1-2 The Pax3/Pax7 involved in Progression of Muscle Progenitor Cells Toward Formatioof Differentiated Skeletal Muscle脊椎动物的细胞增殖主要以有丝分裂的形式进行，从次有丝分裂结束到下次有丝分裂结束则成为个细胞周期。细胞周期的有序进行受到细胞周期素依赖性激酶（CDKs）家族，细胞周期蛋白（Cyclins）家族和多种信号通路等的调节(Nurs2002)。而 p15INK4B、p16INK4A、p18INK4C、p19INK4D、p21Cip1和 p27Kip1等可作为 CDK和 Cyclins 家族基因的抑制因子，导致细胞周期进程受阻，抑制细胞增殖(Besson et 2008; MalumbresandBarbacid 2009)。p21 基因在 G1/S checkpoint 中发挥了重要作用其可以结合并抑制 CDKs 家族基因（包括 CDK1、CDK2、CDK4 和 CDK6）的表达，从而调节 G1 期到 S 期的进程(GartelandRadhakrishnan 2005)。最近的研究揭示 p21Cip基因对骨骼肌肌卫星细胞和成肌细胞的增殖具有重要的作用(Halevy et al 1995WalshandPerlman 1997)，敲除 p21 基因可以促进小鼠肌卫星细胞的增殖(Chinzei et
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.2

【参考文献】