柔嫩艾美耳球虫入侵DF1细胞的转录组学及蛋白质组学分析

发布时间：2020-05-10 09:26

【摘要】：由一种或多种艾美耳球虫引起的鸡球虫病是危害养鸡业最严重的寄生虫病,每年可造成世界范围内高达30亿美元的经济损失。对鸡球虫病的有效防控,取决于对球虫入侵、寄生及致病机制的充分了解。其中,鸡球虫对宿主细胞的入侵是建立感染的第一步,也是进行球虫病防控的最佳时期。目前对于鸡球虫入侵机制及其与宿主相互作用的了解,大多间接来源于弓形虫和疟原虫的已有研究,而且局限于对单个蛋白质或单因素的研究,缺乏系统性和针对性。鸡球虫无法有效的进行体外细胞培养是制约其机制深入研究的瓶颈,且细胞培养条件缺乏标准,存在入侵及发育的不规律性。尽管如此,鸡球虫的细胞培养目前仍是研究球虫入侵机制及其与宿主互作的有效平台。为从整体水平系统分析鸡球虫在入侵宿主细胞过程中球虫和宿主细胞的关键基因或关键蛋白,本研究以柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)为研究对象,以DF1细胞为宿主细胞,通过建立E.tenella体外入侵细胞模型,运用转录组学RNA-seq和蛋白质组学iTRAQ技术分别对入侵模型中DF1细胞和E.tenella子孢子的关键基因及关键蛋白质进行系统筛选鉴定,并对2个E.tenella候选关键蛋白U6KIV9和H9B954的功能进行了初步研究。为鸡球虫的入侵机制以及与宿主的相互作用研究提供了思路与数据参考,并为鸡球虫病的防控提供借鉴。研究内容具体包括以下5部分:1.体外E.tenella入侵DF1细胞模型的建立本研究以DF1细胞为E.tenella的宿主细胞,将E.tenella子孢子接种细胞观察其对细胞的入侵及发育情况,并分别统计不同接种时间和接种剂量对入侵率的影响,确定最佳接种时间和接种剂量,建立E.tenella对DF1细胞的入侵模型。结果显示,E.tenella子孢子可成功入侵DF1细胞,并在细胞内进行第一代裂殖体和裂殖子的发育;子孢子对DF1细胞的入侵率随时间递增,2 h内递增程度最强,2 h后明显减弱,在2 h时入侵率为33.14%;子孢子接种剂量与入侵率密切相关,当剂量小于5×10~5时,入侵率与接种剂量呈正相关,高于5×10~5时入侵率随接种剂量增加而下降,当接种剂量为5×10~5时,入侵率为35.7%。结果表明,成功建立了E.tenella入侵DF1细胞模型,2 h为最佳接种时间点,5×10~5个子孢子接种2.5×10~5个细胞为最佳接种比例。2.入侵模型中宿主细胞DF1的转录组学分析为系统筛选宿主细胞在E.tenella入侵过程中的关键作用基因,本研究以未接种E.tenella的DF1细胞为对照,通过RNA-seq技术对E.tenella入侵模型中宿主细胞DF1的m RNA进行比较转录组学分析。结果显示,共鉴定到DF1细胞的转录基因个数为5744,其中35个为显著调节基因,上调基因32个,下调基因3个。生物信息学分析结果显示,差异基因全部富集到细胞核和转录因子复合物中,具有转录因子活性及序列特异DNA分子结合等功能,参与RNA以及核酸碱基的生物合成和RNA聚合酶II启动的转录调节,在MAPK信号通路中的富集程度最高。荧光定量PCR验证结果与转录组学结果的符合率高达87.5%(7/8),其中差异基因Fos B、NR4A3和NR4A1在E.tenella感染后的DF1和CEF细胞均发生极显著上调转录(P0.01),在E.tenella感染后2 h、4 h和8h的DF1细胞中均呈现高水平转录(P0.05)。结果表明,转录组学筛选的35个差异显著基因可作为宿主细胞在E.tenella入侵过程中的候选关键基因,其中Fos B、NR4A3和NR4A1为重要候选关键基因。3.入侵模型中DF1细胞的蛋白质组学分析为从蛋白水平整体分析E.tenella入侵过程宿主细胞的关键蛋白,本研究以未接种E.tenella的DF1细胞为对照,通过iTRAQ技术对E.tenella入侵模型中宿主细胞DF1的蛋白进行比较蛋白质学分析。结果显示,共鉴定到DF1细胞的有效蛋白3291个,显著调节蛋白302个,其中上调蛋白110个,下调蛋白192个。生物信息学分析结果显示,差异显著蛋白主要定位于细胞核、细胞质及线粒体,具有核酸结合、基因表达、RNA加工及代谢功能,结构域主要富集到RNA识别和核酸结合结构域。上调蛋白在氨酰生物合成、内吞及吞噬体信号通路中有明显富集,下调蛋白主要富集到剪接体信号通路中。4.入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白质组学分析为从系统分析E.tenella入侵宿主细胞过程中E.tenella的关键蛋白,本研究以未接种细胞的E.tenella子孢子为对照,通过iTRAQ技术对E.tenella入侵模型中E.tenella子孢子的蛋白进行比较蛋白质学分析。结果显示,共鉴定到E.tenella的有效蛋白841个,显著调节蛋白81个,其中上调蛋白40个,下调蛋白41个。生物信息学分析结果显示,显著差异蛋白主要是以小核糖体亚群为主要组分的细胞器和超分子复合物,定位于细胞质、细胞核、细胞外以及细胞膜中,具有结合和催化功能,蛋白结构域富集在具有类似PH结构域和吡哆醛磷酸依赖型转移酶主要部位的2型亚结构域。5.E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954的功能研究本研究选取了蛋白质组学筛选到的2个上调表达倍数最高的E.tenella分泌蛋白U6KIV9和H9B954进行功能的初步研究,包括生物信息学分析、基因的克隆表达、多克隆抗体的制备、细胞黏附作用、细胞入侵作用及动物免疫保护效果的评价。生物信息分析结果显示,蛋白U6KIV9同时存在信号肽和跨膜区,不存在已知保守结构域,蛋白H9B954存在信号肽,具有MAR_sialic_bdg结构域。对蛋白的基因进行了成功克隆及蛋白表达,并制备了相应的多克隆抗体。通过建立酵母菌表面展示蛋白黏附试验模型,分别对蛋白U6KIV9和H9B954的细胞黏附作用进行研究,结果显示,表面展示有蛋白U6KIV9或H9B954的酵母菌EBY100对DF1细胞均有明显的黏附作用(P0.05),且蛋白H9B954的黏附作用略高于U6KIV9(P0.05)。通过制备的多克隆抗体对蛋白进行阻断研究其对细胞的入侵作用,结果显示,蛋白U6KIV9和H9B954的多克隆抗体均可明显抑制E.tenella子孢子对DF1细胞的入侵(P0.05),抑制率分别高达33.0±3.13和31.0±4.52;动物免疫保护实验结果显示,免疫蛋白U6KIV9或H9B954可明显改善E.tenella感染造成的鸡体重增长缓慢(P0.05),显著降低卵囊排出量(P0.05),2株蛋白无明显差异。结果表明,E.tenella蛋白U6KIV9和H9B954对宿主细胞均具有黏附和入侵作用,并具有部分免疫保护力。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.723

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