单去势引起的小鼠睾丸DNA甲基化和基因表达的变化
发布时间：2020-05-10 13:17
【摘要】：睾丸作为哺乳动物繁衍的重要生殖器官,主要负责雄性配子的产生以及固醇类性激素的释放。外力、生化或疾病等因素都可能损伤单侧睾丸并影响其正常的功能,甚至造成生殖障碍。单去势作为一种单侧睾丸摘除手术能够去除受损的睾丸,同时引起剩余睾丸激素的改变和代偿性应答,并且可能影响精子的发生。但是,其中可能存在的分子机制还有待进一步地探讨。因此,本试验中我们将探究单去势对剩余睾丸功能的影响。青春期前的小鼠(24日龄)被实施单去势手术,并且测定小鼠的生长发育相关指标直至它们到达体成熟(72日龄)。接着,我们通过简并代表性亚硫酸氢盐测序技术测定了正常和单去势小鼠剩余睾丸的DNA甲基化模式。同时,我们使用RNA测序技术描绘了睾丸基因的表达模式以探究单去势小鼠基因表达与DNA甲基化之间的关系,并探讨了lncRNA可能通过改变DNA甲基化进而调控生精相关基因的表达。结果如下:(1)相较对照组小鼠,单去势并没有显著影响小鼠的生长或睾酮水平(P0.05),小鼠剩余睾丸并没有出现组织学形态结构的变异。(2)剩余睾丸的全基因组DNA甲基化模式表明大量基因在基因体区域含有差异甲基化区域(1,139),这些基因的功能主要富集于蛋白的结合和细胞黏附。(3)mRNA分析结果显示,46个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)在单去势组中表达上调,其功能涉及减数分裂细胞循环、联会复合物的装配和精子发生。同时,197个DEGs表达下调,同肽链内切酶抑制剂的活性以及花生四烯酸的代谢通路有关。(4)19个lncRNA出现差异表达,cis和trans分析结果显示lncRNA-9230019H11Rik、lncRNA-Gm13652和lncRNA-Gm30934的功能可能同肽酶抑制剂的活性有关;lncRNA-1700095K22Rik和lncRNA-Gm36525的功能显著富集于氨基酸的跨膜转运;lncRNA-1700061I17Rik、lncRNA-4930432O09Rik和lncrRNA-4930401O12Rik的潜在功能为花生四烯酸的代谢。(5)联合分析显示,负责编码精母细胞同源重组的关键蛋白的基因PSMC3IP(Proteasome 26S subunit ATPase 3 interacting protein),在单去势小鼠中表现出启动子区域低甲基化且表达水平升高,并且与3个lncRNA(lncrRNA-4930401O12Rik、lncRNA-9230019H11Rik和lncRNA-Gm13652)的表达显著负相关。单去势引起的小鼠睾丸全基因组DNA甲基化的变化与睾丸功能有关,并且调控相关基因的表达以参与精子的发生。
【图文】：
图 1-1 睾丸的解剖学结构和精子发生的过程（此图引用于 L.B. Smith and W.H. Walker, 2014[14]）Fig.1-1 The anatomy of the testis and the process of spermatogenesis1.1.2 单去势对于睾丸影响的研究进展外力、生化影响或疾病等因素都可能损伤单侧睾丸，进而导致机体的生殖障碍。单去势作为一种单侧睾丸摘除术，能够去除受损的睾丸。有研究表明单去势可以提供初始精子含量和分布的情况，并可以作为一种理想的模型用于研究睾丸的调控和发育[15, 16]。对青春期前的公牛和大鼠实施单去势会造成其剩余睾丸的肥大，这可能同血清中促卵泡激素水平的变化有关[17, 18]。同样，对绵羊和种马实施单去势后，会观察到睾丸的肥大现象[19, 20]。为进一步探究单去势后造成睾丸代偿性肥大的机理，Lunstra 等通过对不同发育阶段的雄性猪进行单去势后发现，代偿性肥大的效果同实施单去势的时间早晚呈负相关，年纪越小肥大越明显，同时，对睾丸间质细胞和支持细胞的数量进行统计，发现单去势后剩余睾丸的肥大可能同间质细胞的增殖以及支持细胞的增生2
图 4-1 72 日龄对照组小鼠（左图）和单去势小鼠（右图）右侧睾丸经苏木精和伊红的石蜡切片。标尺：100 μmFig. 4-1 Hematoxylin & Eosin (H&E) staining of paraffin sections of right testis from 72 days-oldcontrol (left) and hemicastrated (right) mice. Scale bar:100 μm4.2 单去势引起了睾丸 DNA 的差异甲基化为了探究单去势小鼠睾丸 DNA 甲基化的变化，从 72 日龄对照组和单去势组小鼠中分别挑选三个生物学重复，抽提其睾丸 DNA 进行 RRBS 建库测序。测序结果如下表，reads 长度为 100 bp，，每个样本得到平均约 5G 的数据，GC 含量约为 32%，比对率在 80%以上（表 4-2）。表 4-2 简化的亚硫酸氢盐测序比对到参考基因组的结果Table 2 Summary of reduced representation bisulfite sequencing read alignment to the referencegenomeIndividual Read leghth (bp） Clean data GC (%) Aligned (%) Unique (%)Control 1 100 52,392,308 32.72 83.96 67.05
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S814.1
【图文】：
图 1-1 睾丸的解剖学结构和精子发生的过程（此图引用于 L.B. Smith and W.H. Walker, 2014[14]）Fig.1-1 The anatomy of the testis and the process of spermatogenesis1.1.2 单去势对于睾丸影响的研究进展外力、生化影响或疾病等因素都可能损伤单侧睾丸，进而导致机体的生殖障碍。单去势作为一种单侧睾丸摘除术，能够去除受损的睾丸。有研究表明单去势可以提供初始精子含量和分布的情况，并可以作为一种理想的模型用于研究睾丸的调控和发育[15, 16]。对青春期前的公牛和大鼠实施单去势会造成其剩余睾丸的肥大，这可能同血清中促卵泡激素水平的变化有关[17, 18]。同样，对绵羊和种马实施单去势后，会观察到睾丸的肥大现象[19, 20]。为进一步探究单去势后造成睾丸代偿性肥大的机理，Lunstra 等通过对不同发育阶段的雄性猪进行单去势后发现，代偿性肥大的效果同实施单去势的时间早晚呈负相关，年纪越小肥大越明显，同时，对睾丸间质细胞和支持细胞的数量进行统计，发现单去势后剩余睾丸的肥大可能同间质细胞的增殖以及支持细胞的增生2
图 4-1 72 日龄对照组小鼠（左图）和单去势小鼠（右图）右侧睾丸经苏木精和伊红的石蜡切片。标尺：100 μmFig. 4-1 Hematoxylin & Eosin (H&E) staining of paraffin sections of right testis from 72 days-oldcontrol (left) and hemicastrated (right) mice. Scale bar:100 μm4.2 单去势引起了睾丸 DNA 的差异甲基化为了探究单去势小鼠睾丸 DNA 甲基化的变化，从 72 日龄对照组和单去势组小鼠中分别挑选三个生物学重复，抽提其睾丸 DNA 进行 RRBS 建库测序。测序结果如下表，reads 长度为 100 bp，，每个样本得到平均约 5G 的数据，GC 含量约为 32%，比对率在 80%以上（表 4-2）。表 4-2 简化的亚硫酸氢盐测序比对到参考基因组的结果Table 2 Summary of reduced representation bisulfite sequencing read alignment to the referencegenomeIndividual Read leghth (bp） Clean data GC (%) Aligned (%) Unique (%)Control 1 100 52,392,308 32.72 83.96 67.05
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S814.1
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本文编号：2657359
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