捻转血矛线虫Hc-tgfbr1，Hc-tgfbr2和Hc-tgh-2基因结构和功能的研究

发布时间：2020-05-10 13:36

【摘要】：捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是寄生于反刍动物皱胃的重要致病性寄生线虫之一,能引起宿主消瘦、贫血和衰弱等临床症状,严重时可致病宿死亡,给全球畜牧业造成了巨大的经济损失。目前捻转血矛线虫病的治疗主要依赖于化学药物,尚未有可行性的疫苗应用于临床。然而化学药物的长期大量使用,不仅造成了严重的药物残留问题,还使世界各地产生多种捻转血矛线虫抗药虫株,因此研发新的药物靶标和疫苗候选分子对防治捻转血矛线虫病尤为重要。Dauer假说提出寄生线虫感染性三期幼虫(iL3)与秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)dauer幼虫在形态发育和调控机制上均有相似之处,这为研究寄生线虫发育机制提供了新的思路。秀丽新杆线虫中调控dauer形成的信号传导通路有环鸟苷酸信号通路、dauerβ转化生长因子样信号通路、胰岛素样生长因子信号通路和激素样通路四种,其中胰岛素样生长因子信号通路被证实存在于捻转血矛线虫中,并且该通路中的重要分子如胰岛素样受体Hc-DAF-2、磷脂酰肌醇3-激酶Hc-AGE-1和Hc-AAP-1,3-磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶Hc-PDK-1和叉头转录因子Hc-DAF-16等在捻转血矛线虫的发育过程中均起到重要调控作用。这为dauer假说应用于捻转血矛线虫的发育机制研究提供了实质性依据,但我们对dauerβ转化生长因子样信号通路(TGFβ信号通路)在调控捻转血矛线虫发育中的作用仍然一无所知。本研究通过分子生物学和生物信息学方法分离得到了TGFβ信号通路(DAF-7通路)中重要分子TGFβ配体(Hc-tgh-2)、TGFβI型受体(Hc-tgfbr1)和TGFβII型受体(Hc-tgfbr2),并分析了这三个基因在捻转血矛线虫不同发育阶段的转录水平;利用异源转基因技术研究了Hc-tgfbr1和Hc-tgfbr2在秀丽新杆线虫中的空间表达谱,并用基因救援方法检测了Hc-tgfbr1对于秀丽新杆线虫daf-1(DR40)突变株的救援作用;分别用原核表达的三个蛋白免疫家兔制备多克隆抗体检测相应蛋白在捻转血矛线虫成虫中的定位;利用TGFβI型受体特异性抑制剂LY2157299和RNAi技术研究了这三个基因在捻转血矛线虫发育过程中的调控作用。(1)捻转血矛线虫TGFβI型受体(Hc-tgfbr1)的基因结构和功能研究Hc-tgfbr1的全长gDNA为4,998 bp,含16个外显子和15个内含子;全长CDS为1,779bp,可编码592个氨基酸。进化分析显示,Hc-TGFBR1属于TGFβI型受体蛋白家族;氨基酸序列比对发现Hc-TGFBR1具有TGFβI型受体保守的功能域,其胞外含有保守的半胱氨酸残基数个,胞内有TGFβI型受体特有的甘氨酸丝氨酸富集功能域(GS功能域)和保守的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶区。转录水平分析显示Hc-tgfbr1在捻转血矛线虫不同发育阶段持续表达,在寄生雌虫和iL3转录水平较高。TGFβI型受体特异性抑制剂LY2157299和特异性Hc-tgfbr1 dsRNA均可导致捻转血矛线虫xL3发育至L4的比例明显下降。免疫组织化学方法检测Hc-TGFBR1蛋白定位在捻转血矛线虫成虫的肠道细胞、外角质层以及性腺等处;异源转基因技术结果显示Hc-tgfbr1能特异性表达在秀丽新杆线虫的部分肠道细胞(int I和int IX),但是该基因对于秀丽新杆线虫daf-1(DR40)突变株没有救援效果。(2)捻转血矛线虫TGFβII型受体(Hc-tgfbr2)的基因结构和功能研究Hc-tgfbr2的全长gDNA为16,150 bp,含16个外显子和15个内含子;全长CDS为1,998 bp,可编码665个氨基酸。进化分析显示Hc-TGFBR2为TGFβII型受体家族成员,氨基酸序列比对显示该蛋白为跨膜丝氨酸苏氨酸蛋白激酶,胞外含有一个由多个保守的半胱氨酸参与组成的TGFβII型受体典型cluster结构(CXCX_4C),胞内含有保守的蛋白激酶区。转录水平分析显示Hc-tgfbr2在捻转血矛线虫各个阶段均有转录,其中在iL3阶段转录水平最高,其次是雄性成虫阶段。体外RNAi实验显示Hc-tgfbr2转录水平的降低能导致捻转血矛线虫xL3发育至L4的比例明显下降。免疫组织化学实验显示Hc-TGFBR2蛋白定位于捻转血矛线虫成虫肠道和性腺;异源转基因技术结果显示Hc-tgfbr2能特异性表达在秀丽新杆线虫的肠道细胞和咽部后球部。(3)捻转血矛线虫TGFβ配体(Hc-tgh-2)的基因结构和功能研究Hc-tgh-2的全长gDNA为14,938 bp,含10个外显子和9个内含子;全长CDS为1,050bp,可编码349个氨基酸。进化分析显示Hc-TGH-2为TGFβ配体家族成员,氨基酸序列比对显示该蛋白具有保守的TGFβ2配体结构域,该结构域中存在多个保守的半胱氨酸残基。转录水平分析显示Hc-tgh-2在捻转血矛线虫的8个不同发育阶段均有转录,但转录水平普遍偏低,其中iL3阶段转录水平最高。体外RNAi实验显示Hc-tgh-2转录水平的降低可导致捻转血矛线虫xL3发育至L4的比例明显下降。免疫组织化学实验显示Hc-TGH-2蛋白定位于捻转血矛线虫成虫肠道、外角质层和性腺等部位。本研究首次探索了捻转血矛线虫TGFβ信号通路(DAF-7通路)的三个重要分子的基因结构和功能,深入探讨了捻转血矛线虫发育机制尤其是从自由生活向寄生生活阶段转变过程的调控机制,为开发捻转血矛线虫新的药物靶标和疫苗候选分子提供了一定的理论基础。
【图文】：

捻转血矛线虫,生活史,皱胃

此后移行至皱胃，，在皱胃内经过两次蜕皮分别发育成四期幼虫（L4）和成虫（adult），此过程约需 3 周（图1-1）（Nikolaou and Gasser 2006）。此后捻转血矛线虫一直寄生于宿主皱胃内，偶有部分成虫寄生于小肠，成虫产卵随粪便排出体外进行新一轮发育（李国清 2006；宋铭忻和张龙现 2009）。图 1-1 捻转血矛线虫生活史（Nikolaou and Gasser 2006）Fig. 1-1 Life cycle of Haemonchus contortus (Nikolaou and Gasser 2006)

形态图,捻转血矛线虫,形态,交合伞

图 1-2 捻转血矛线虫部分形态（李国清 2006）1：成虫头部；2：雌性成虫生殖孔部；3：雄性成虫交合伞Fig. 1-2 Partial morphology of Haemonchus contortus (Guoqing Li 2006)terior end of adults; 2: Genital pore of female adult; 3: Copulatory bursa of male adu
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.731

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