牛乳源粪肠球菌溶血素Cyla基因的克隆及其原核表达

发布时间：2020-05-11 15:52

【摘要】：克隆牛乳腺炎粪肠球菌溶血素Cyla基因,构建Cyla基因抗原优势区序列的重组原核表达载体,转入到大肠杆菌感受态细胞BL21中表达,并对其表达蛋白的免疫反应活性鉴定,为建立奶牛粪肠球菌性乳腺炎的流行病检测奠定了良好的实验基础。分离患乳腺炎的乳样,分离出具有溶血表型的菌株,并提取其基因组DNA,通过16S rDNA序列分子鉴定,确定为粪肠球菌;根据GenBank公布的Cyla基因序列设计1对克隆引物,PCR扩增出Cyla基因抗原优势序列,并构建重组表达质粒pET-30a(+)-Cyla,转化至大肠杆菌感受态BL21细胞中,经IPTG诱导、表达并优化诱导条件,通过SDS-PAGE电泳鉴定、Ni~(2+)亲和层析纯化、Western-blot鉴定表达蛋白的免疫反应活性。测序结果显示,成功克隆粪肠球菌溶血素Cyla基因,序列长度为1239 bp,共编码413个氨基酸残基。经测序和酶切分析表明,成功构建原核表达重组质粒pET-30a(+)-Cyla,在大肠杆菌感受态BL21细胞中获得高效表达,诱导产物相对分子质量为44 ku,纯化后的蛋白含量为2.44 mg/m L,经Western-blot结果表明重组蛋白具有很好的免疫反应原性。乳腺炎粪肠球菌溶血素Cyla基因的抗原表位序列编码的蛋白具有良好的免疫反应活性性,可以做为奶牛粪肠球菌性乳腺炎流行病检测的活性抗原。
【学位授予单位】：内蒙古民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61

【参考文献】

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本文编号：2658702