猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒性疫病多重PCR方法的建立及应用

发布时间：2020-05-11 12:48

【摘要】：猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多研究表明:猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)等在临床上多引起猪的呼吸道类与繁殖障碍类疫病,且常呈混合或继发感染,导致了猪群的高发病率和高死亡率,使得诊断和防治难度加大。为实现临床猪呼吸道类与繁殖障碍类病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的七重PCR检测方法并进行了初步应用,为相关疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段,同时针对七重PCR检测出的单一或混合感染的阳性病毒组织病料,进行了部分病毒相关毒力基因或抗原基因的克隆及序列分析,从分子生物学角度分析贵州省近年来流行的部分猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒的遗传变异情况,为今后这些病毒的防控提供理论依据。主要研究内容如下:1.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR检测方法的建立参照GenBank上PRRSV ORF6(AY262352)、PCV2 ORF2(KY806071)、PPV NS1(AY502114)、PRV gB(JX41771)、SIV M(LC371845)、JEV NS1(M55506)和CSFV E2(AF092448)等基因的部分片段,应用相关软件设计了7对引物,分别用于扩增PRRSV ORF6、PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、SIV M、JEV NS1和CSFV E2基因的部分片段。将实验室已保存的PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等病毒接种到已长满单层易感细胞上进行病毒的增殖,分别提取毒液中的核酸作为模板,通过对7种病毒单一PCR扩增产物的鉴定,并对其退火温度和敏感性进行优化和检测,建立一种快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7种常见猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒的单一PCR检测方法;在该方法的基础上,选择合适的七重PCR缓冲体系及酶,摸索退火温度、模板及引物浓度,最后对七重PCR进行特异性、敏感性及重复性检测,建立一种能够同时且快速鉴别PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV等7种常见猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒性疫病的多重PCR检测方法。单一病毒PCR检测方法的建立结果表明:(1)最佳反应体系:7对引物浓度均为10μmoL·L~(-1),PRRSV、PCV2、PPV上下游引物各1μL,PRV、SIV、JEV、CSFV上下游引物各1.5μL,模板DNA/cDNA各2μL,金牌MiX(Green)补足25μL。(2)最佳反应条件:单一病毒PCR的退火温度在50~60℃间均可扩增出特异的条带,7种病毒的最佳反应程序均为:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45 s,35个循环;72℃10 min。(3)敏感性结果表明:7种病毒的最低核酸检测量分别为:PRRSV 0.47 pg、PCV2 0.33 pg、PPV 34 pg、PRV 1.2pg、SIV 0.18pg、JEV 8.5 pg、CSFV 0.8 pg。七重PCR检测方法的建立结果表明:(1)最佳反应体系:PCR反应总体系为50μL时最佳,上下游引物浓度均为10μmoL·L~(-1),引物量PRRSV、PCV2、PPV、SIV各0.5μL,PRV、JEV、CSFV各1μL,DNA/cDNA模板:PRRSV、PCV2、PPV、SIV各1μL,PRV、JEV、CSFV各1.5μL,金牌MiX(Green)补足50μL。(2)最佳反应条件:94℃5 min;94℃45 s;54℃45 s;72℃45s,35个循环;72℃10 min。(3)特异性、敏感性和重复性试验结果表明:七重PCR能扩增出PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV的特异性片段,分别为224 bp、353 bp、424 bp、549 bp、684 bp、831 bp、1 121 bp,未扩增出E.coli、APP、PEDV及正常细胞组织的DNA/RNA;七重PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PRRSV 94 pg、PCV2 66 pg、PPV 68 pg、PRV 20 pg、SIV 35 pg、JEV 17 pg和CSFV 14 pg;6次重复试验均能扩增出一致的目的条带。研究建立的猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒七重PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点。2.PRRSV、PCV2、PPV、PRV、SIV、JEV和CSFV七重PCR检测方法在临床样品中的应用应用所建立的猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒性疫病七重PCR检测方法对2017~2019年贵州部分地区的150份临床病料进行检测。结果表明:150份临床病料中2种病毒混合感染阳性率高达66%(99/150),其中PCV2+PRRSV混合感染的阳性率较高,达42.67%(66/150),PCV2+PRV混合感染的阳性率为8%(12/150)、PCV2+CSFV混合感染的阳性率为2.67%(4/150)、PCV2+JEV混合感染的阳性率为3.33%(5/150)、PCV2+PPV混合感染的阳性率为0.67%(1/150)、PRV+CSFV混合感染的阳性率为2%(3/150)、PRV+JEV混合感染的阳性率为5.33%(8/150);3种病毒混合感染阳性阳性率达11.33%(17/150),其中PCV2+SIV+JEV混合感染的阳性率为2%(3/150)、PCV2+PRV+JEV混合感染的阳性率为3.33%(5/150)、PCV2+PRRSV+CSFV混合感染的阳性率为1.33%(2/150)、PCV2+PRRSV+JEV混合感染的阳性率为4.67%(7/150);4种病毒PCV2+PRRSV+PRV+CSFV混合感染阳性率达2%(3/150),5种病毒PCV2+PRRSV+JEV+PRV+CSFV混合感染感染阳性率达0.67%(1/150);6种和7种病毒混合感染阳性率均为0。阳性PRRSV、PCV2、PPV、JEV、SIV的多重PCR与单一PCR的符合率均为100%,阳性CSFV和PRV的符合率为90%以上。3.规模化猪场猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒部分流行毒株的遗传变异研究参照GenBank上PRRSV ORF5和Nsp2(EF635006)、JEV E(M55506)、CSFV E2基因(AF092448)、PRV gE(KM061380)、PCV2全基因(KU041852)等基因的基因序列,用primer 5.0设计用于扩增目的基因片段的引物,基于对猪呼吸道类和繁殖障碍类病毒性疫病混合感染情况的检测及分析,选取本研究中经七重PCR检测结果为PRRSV、PCV2、PRV、JEV、CSFV单一或混合感染的阳性临床病料为模板,对PRRSV ORF5和Nsp2基因、PCV2全基因、PRVgE基因、JEV E基因、CSFV E2基因进行克隆和遗传变异分析。克隆的4条PRV gE基因氨基酸序列在第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,且与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株gE基因氨基酸序列在448位均由V→I,属于PRV变异株。克隆的8条PCV2全基因序列均属于PCV2d基因型。克隆的5条PRRSV ORF5基因在蛋白抗原表位:2个为非中和表位(aa27~aa30和aa180~aa197)和1个为中和表位(aa 37~aa 45)区域均未发生突变;此外,5条PRRSV Nsp2基因的蛋白均存在第481位和532~560位2处不连续的氨基酸缺失位点,和高致病性猪蓝耳病病毒毒株序列的缺失位点一致,为同一分支,亲缘关系也最近。克隆的4条CSFV E2基因序列的病毒抗原性、毒力有关的氨基酸位点未发生大的变化,部分CSFV E2基因的24位G→E,36位N→D,45位K→R、49位V→T,贵州省的猪瘟病毒E2基因向远离经典株和疫苗株的方向发展,和近年来流行的中国分离株处于同一遗传进化分支。克隆的4条JEV E基因序列在E304和E335两个位点的Cys都没有发生变异,在决定JEV毒力的10个关键性氨基酸位点(E107、E138、E176、E177、E244、E264、E279、E315、E439、E447)上均无变异,在E60~68的氨基酸位点和疫苗株SA14-14-2株完全一致。
【图文】：

细胞,毒力,病料

A：正常 Vero 细胞；B：接 PRV 24 h；C：接 PRV 48 h；D：接 PRV 60 h；E：接 PRV 72 h；F：接 PRV 96 hA: normal Vero cells; B: connected to PRV 24 h; C: connected to PRV for 48 h;D: connected to PRV 60 h; E: connected to PRV 72 h; F: connected to PRV 96 h图 2-1 PRV 在 Vero 细胞上的病变结果Fig. 2-1 Lesion of PRV on Vero cells3.1.2 PRRSV 的增殖取 0.5 mL PRRSV 接种长满成单层的 Marc-145 细胞，，部分病料能在第一代使 Marc-145 细胞出现细胞变圆、破碎、折光性改变、聚集，最后脱落的现象（图2-2），传代后出现毒力减弱现象。DE F

MDCK细胞,细胞,毒液

A：正常 BHK-21 细胞；B：接 JEV 12 h；C：接 JEV 24 h；D：接 JEV 48 h；E：接 JEV 72 h；F：接 JEV 96 hA: normal BHK-21 cells; B: JEV 12 h; C: JEV 24 h;D: JEV 48 h; E: JEV 72 h; F: JEV 96图 2-3 JEV 在 BHK-21 细胞上的病变结果Fig.2-3 Lesion of JEV on BHK-21 cells.4 SIV 的增殖取 0.5 mLSIV 毒液接种于已长满成单层的 MDCK 细胞，未出现明显的象（图 2-4）。DE
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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