【摘要】：近年来,禽类养殖业在不断扩大,人们对于禽肉和蛋类的消费水平也在不断提升,但抗生素药物滥用现象愈来愈严重,各种超级细菌和病毒层出不穷,传统的禽类疫苗已经无法满足市场需求,开发新型疫苗迫在眉睫。目前已经开发出的新型疫苗需要佐剂的添加来提高其免疫水平,干扰素和补体分子是目前已证明的具有佐剂效应的活性分子,但目前的报道都是对二者单独进行的,本实验欲将IFN-γ和补体C3d串联表达,并与单独表达的IFN-γ对比,观察其抗病毒活性。本实验成功获取了目的基因chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,并构建了真核重组质粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d,通过酶切鉴定和测序鉴定来验证构建的正确性。构建成功后,将真核质粒pPICZαA-chIFN-γ和pPICZαA-chIFN-γ-C3d线性化后电转化导入毕赤酵母SMD1168中,甲醇诱导目的蛋白的表达,并对其最佳诱导时间进行了选择。SDS-PAGE结果表明,chIFN-γ和chIFN-γ-C3d在17KDa和21KDa各有一个条带,与理论值相符,Western-Blotting检测也验证了目的蛋白表达的正确性。重组蛋白表达成功后,用镍柱对重组蛋白进行纯化,纯化后蛋白浓度为chIFN-γ0.427mg/mL,chIFN-γ-C3d 1.069mg/mL。将本实验中真核表达的重组蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d以及实验室保存的原核表达的重组蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d进行鸡胚内和鸡胚成纤维细胞(CEF)抗病毒活性比较。在鸡胚内进行的抗病毒实验结果表明,四个重组蛋白均具有较好的抗病毒活性,与病毒组相比差异极显著(P0.01),在低浓度时,chIFN-γ比chIFN-γ-C3d效果好,高浓度时,chIFN-γ-C3d组病毒滴度明显下降,差异极显著(P0.01),原核表达的chIFN-γ-C3d与真核表达的chIFN-γ-C3d抗病毒活性差异不显著(P0.05),在CEF上进行的抗病毒实验结果表明在相同处理方式下,从病毒滴度测定结果来看,四个重组蛋白之间无明显差异,但chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,MTT测定表明四个重组蛋白抗病毒效果显著,与病毒组相比差异极显著(P0.01)。四个重组蛋白都随着浓度的增大抗病毒效果逐渐增强,但差异不显著(P0.05)。总体来看,chIFN-γ-C3d效果要好于chIFN-γ,本实验真核表达的重组蛋白好于实验室保存的原核表达的重组蛋白,但差异不显著(P0.05)。综上所述,本实验成功在毕赤酵母中表达了重组蛋白chIFN-γ和chIFN-γ-C3d,它们都具有良好的抗病毒活性,为后面进行免疫佐剂功能研究奠定了基础,也为新型疫苗免疫佐剂开发提供了一种新的思路。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S852.4
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本文编号：2658457
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