旋毛虫ES抗原致小鼠DCs吲哚胺2，3-双加氧酶表达的影响

发布时间：2020-05-12 00:13

【摘要】：寄生旋毛形线虫(Trichinella spiralis,T.spiralis),简称旋毛虫,是骨骼肌特有的细胞内寄生虫,能够感染多种哺乳动物,包括人类,并广泛引起人及其他动物旋毛虫病(Trichinellosis)。旋毛虫通过其排泄分泌(Excretion-secretory,ES)产物对宿主免疫反应发挥免疫调节作用。旋毛虫及其产物通过抑制宿主免疫反应,从而有利于其在宿主体内的生存。树突状细胞(Dendritic Cell,DCs)被归类为高度有效的专业抗原递呈细胞,在免疫系统中执行分泌细胞因子和其他免疫功能分子等多种功能,从而介导机体免疫应答。吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是存在于DCs的一种强效免疫酶,DCs表面的IDO与寄生虫的免疫逃避有关。但旋毛虫ES抗原通过何种途径诱导DCs免疫耐受的分子逃避机制尚不清楚,IDO对参与虫体免疫逃避的作用机制尚不明确。为了探究IDO介导免疫耐受与旋毛虫免疫逃避之间存在的关系,本研究以小鼠骨髓来源的DCs为模型,设空白对照组、1640组、ES抗原组及IFN-γ组。DCs经各组刺激剂作用后,细胞免疫荧光技术初步检测IDO蛋白在DCs表面的表达情况;流式细胞术检测细胞表面标志分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表达情况,实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)动态检测不同时间点IDO及下游细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-γmRNA的表达水平,Western blot方法检测IDO蛋白的表达水平。siRNA620干扰后,qRT-PCR法重新检测IDO及下游相关细胞因子mRNA的表达水平,Western blot方法检测IDO蛋白的表达水平。根据GenBank中登录的小鼠IDO,IFN-γ,TNF-α,IL-10和β-actin基因序列,分别设计合成荧光定量PCR引物,建立实时荧光定量PCR检测方法。细胞增殖活力(CCK-8)实验结果表明,ES抗原作用浓度0~25μg/mL内对DCs活力无影响。qRT-PCR结果显示,当不同浓度的旋毛虫ES抗原或作用时间不同时,DCs的IDO mRNA表达量不同,并在一定时间内与剂量和时间存在依赖性效应。在0~24 h内,随时间的增加,IDO mRNA表达量增加,与0h相比,24 h时IDO mRNA表达水平最高,差异最显著(P0.001)。因此,15μg/mL的旋毛虫ES抗原在24 h时,能最大限度的促进IDO mRNA的表达,最终我们选择15μg/mL的旋毛虫ES抗原浓度作为工作浓度。细胞免疫荧光实验结果表明,ES抗原能高效促进IDO在DCs胞质中的表达。流式细胞术结果显示,DCs经旋毛虫ES抗原、脂多糖(LPS)刺激后,其表面分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表达水平都有不同程度的升高。LPS能显著促进DCs表面分子的高表达,与ES抗原组相比差异显著(P0.001),证明LPS能促进DCs成熟,增强DCs的免疫活力。而经ES抗原作用后,表面分子的表达并不显著,抑制DCs的成熟,使其停留在半成熟状态,抑制DCs抗原提呈能力,促进虫体的免疫逃避。qRT-PCR结果表明,ES抗原能高效促进IDO在DCs的表达。在0~24 h时间段内,DCs在15μg/mL的ES抗原刺激下,IDO mRNA的表达存在时间依赖效应,随着时间的增加,IDO mRNA表达量显著增加,24~72 h时间段内,IDO mRNA表达量逐渐降低,最后趋于平衡。ES抗原均能显著促进IDO下游抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α及IFN-γmRNA表达。Western blot结果显示,ES抗原能显著促进DCs IDO蛋白的表达,且在0~36 h时间内,IDO蛋白的表达水平持续升高,呈时间依赖性效应,36 h时表达水平到达峰值,随后略有降低,趋于稳定。DCs经siRNA620干扰后,15μg/mL的ES抗原刺激36 h,qRT-PCR和Western blot法检测IDO mRNA及蛋白表达水平的抑制效率,qRT-PCR再次检测下游细胞因子IL-10、TNF-α及IFN-γmRNA的表达水平,结果显示,siRNA620能有效抑制IDO mRNA及蛋白的表达,与单ES抗原组相比,差异性显著(P0.001);siRNA620干扰后,单ES抗原组相比,促炎因子TNF-α,IFN-γmRNA表达水平显著升高,抗炎因子IL-10 mRNA表达水平显著降低。以上结果证实,在一定的剂量和时间的作用下,旋毛虫ES抗原刺激DCs后,通过上调共刺激分子CD40、MHC-Ⅱ、CD80及CD86的表达,诱导DCs表面IDO mRNA及蛋白表达,从而上调促炎因子TNF-α,IFN-γ和抗炎细胞因子IL-10的表达,使DCs处于免疫耐受状态,有助于旋毛虫逃避机体识别,得以在宿主体内持续生存,造成宿主持续性慢性感染。结果表明ES抗原对DCs的持续刺激可能通过IDO介导的炎症相关信号诱导DCs处于免疫耐受状态。这不仅为研究线虫的免疫调节机制提供了体外模型,也为临床治疗旋毛虫病及研制有效的疫苗提供新的依据和思路。
【图文】：

荧光检测,质量标准,荧光

21：蛋白分子质量标准；1：Eotein molecular weight Marker;3-1 ES 抗原的 SDS-PAGE 1 SDS-PAGE analysis of ES荧光检测原、IFN-γ、1640 刺激 24促进 IDO 表达，在 DCs 的荧光，未见 IDO 表达。

旋毛虫,抗原,活力

图 3-2 细胞免疫组织化学法检测不同处理组 DCs 表达 IDO 的情况Fig.3-2 Detection of IDO on DCs of different treatment groups by cellularimmunohistochemistry3.3 旋毛虫 ES 抗原对 DCs 增殖活力的影响
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.7

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