基于牛PON-1单克隆抗体的夹心ELISA方法建立与初步应用

发布时间：2020-05-12 01:26

【摘要】：目前,酮病与脂肪肝已成为我国集约化牧场高产奶牛围产期常见的且多发的主要营养代谢病之一。因它造成奶牛泌乳量下降,诱发奶牛发生真胃变位,胎衣不下或生产瘫痪等其他疾病。给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。然而,奶牛脂肪肝的诊断技术依然停留在通过活体奶牛肝脏穿刺来检测肝脂浸润程度,并且临床上奶牛活体肝穿刺因保定困难、损伤肝脏、检测费用高等原因,难以被养殖场接受。迄今为止,国内外缺乏一种快速、实用且准确监测奶牛脂肪肝的方法。鉴于国外已开发和应用对氧磷酸酶-1(PON-1)酶联免疫(ELISA)方法监测奶牛脂肪肝和酮病,但价格昂贵,而国内缺发自主研发的类似产品。为此,本研究研制牛PON-1单克隆抗体,以此为基础建立PON-1双抗夹心ELISA检测方法,并实施临床应用试验,为今后国内奶牛酮病和脂肪肝的快速监测提供新的技术。本研究运用原核表达技术将优化的牛属PON-1蛋白基因克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒PET28a-PON-1。将PET28a-PON-1转化表达的菌株扩增培养,在IPTG诱导下表达,经纯化得到约37KD的重组牛PON-1蛋白。而后,用重组牛PON-1蛋白免疫Balb/c小鼠获得一株稳定分泌特异性抗体且效价高的杂交瘤细胞株4K2D。并将4K2D注入经产的Balb/c小鼠腹腔,收集的腹水经AKTA蛋白纯化系统纯化,获得牛PON-1单克隆抗体。另外,以重组牛PON-1蛋白为抗原免疫家兔,血清经AKTA蛋白纯化系统纯化,获得牛PON-1蛋白的多克隆抗体。最后利用纯化的单抗为检测抗体,纯化的多抗为捕获抗体,辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG作为酶标二抗,成功构建牛PON-1蛋白双抗夹心ELISA检测方法。本研究将自主创建的牛PON-1双抗夹心ELISA方法进行临床试验。随机采集产犊后14-21天的奶牛血清62头份,用生化分析仪检测血清中BHBA、GLU、AST、NEFA的水平,根据BHBA含量将其分为酮病组和健康对照组,用所研发的牛PON-1双抗夹心ELISA方法检测试验奶牛血清PON-1的含量。结果显示:酮病组与对照组比较,血清PON-1含量显著的下降(P0.05),与商用牛PON-1酶联免疫试剂盒的结果比较无显著差异。并且,依据显著性分析、相关性分析和二元回归及受试者工作特征曲线(ROC)分析,确定牛血清PON-1可作为奶牛酮病发生的风险预警指标,其预警值为62.37nmol/L。结论:本研究自主创建了牛PON-1双抗夹心ELISA方法,确立基于PON-1的奶牛酮病和风险预警指标及其预警值,为今后监测奶牛酮病和脂肪肝提供新的技术。
【图文】：

Figure 2.1.1 pET-28a plasmid sequence矩形框中为双酶切位点2.1.2.2 优化基因序列根据 GENBANK 中查询的牛 PON-1 的基因序列（XP616349）并利用大肠杆菌偏爱密码子优化（http//www.jcat.de/start.jsp，host organism: E.coil strain K12），最终得到优化后基因序列。2.1.2.3 目的基因合成根据优化后基因序列进行目的基因合成，本部分实验交由金唯智生物科技有限公司完成，公司合成的目的基因附加在 pUC57 载体质粒中。2.1.2.4 提取质粒从液氮中取出 E.Coli DH5ɑ宿主菌（含 pET-28a 质粒）和公司提供的宿主菌（含 pUC57质粒），分别添加 50μL 冻存菌液在 5mL 的 LB 培养基中（预加 Amp），37℃孵育过夜。根据 AXYGEN 公司的质粒提取试剂盒说明书，按照操作步骤提取质粒。质

图 2.1.4 合成基因和菌液基因测序的对比结果Figure 2.1.4 Contrast results for synthetic and sequencing g2.1.3.5 蛋白诱导表达 SDS-PAGE 电泳检测保种的阳性表达菌经公司测序，确定目的片段成功进入表达菌体后，扩在一定时间后加入 IPTG 诱导表达。大量表达后收菌，经 SDS-PAGE 凝胶表达了 37KD 大小的目的蛋白（图 2.1.5a）。表达的蛋白经超声离心，分涵体中蛋白表达，37KD 目的蛋白在包涵体中表达（图 2.1.5b）
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23

【参考文献】

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本文编号：2659397