出壳雏鸡病原菌分析及粪肠球菌定量PCR检测方法的建立

发布时间：2020-05-12 11:12

【摘要】：胚胎期以及刚出壳的雏鸡处于其生命最脆弱的时期,该阶段发育还不完善,抵抗力较差,容易受到外界各种因素影响而导致疾病发生,造成孵化率低、健雏率低,对孵化场和种鸡场的经济效益产生很大影响。因此,调查研究目前导致雏鸡胚胎病的主要病原菌的种类,对雏鸡胚胎病和提高雏鸡的成活率具有重要的意义。1、为调查病、弱感染雏鸡胚胎的主要病原菌,采集了90只刚出壳的病、弱雏鸡。解剖观察其病理变化,从肝脏分离细菌,观察细菌的菌落菌体形态,提取分离菌株的DNA、进行16SrDNA基因序列的扩增并测序,再将测序结果与GenBank数据库的标准株序列比对,最终将比对结果与菌落菌体形态相结合,对分离菌株进行鉴定。结果发现病、弱雏鸡腹围较大;解剖发现皮下胶冻样,卵黄吸收不良,肝呈土黄色;显微镜下显示肝充血,脂肪变性。从病、弱雏鸡的肝脏分离出菌株56株,分离率为62.2%(56/90)。其中粪肠球菌分离率为46.4%(26/56),大肠杆菌为16.1%(9/56),金色葡萄球菌为14.3%(8/56),奇异变形杆菌为8.9%(5/56),鲍氏不动杆菌为5.3%(3/56),沼泽考克氏菌为3.6%(2/56),柠檬酸细菌属为1.8%(1/56),无色杆菌为1.8%(1/56),地衣芽胞杆菌为1.8%(1/56)。结果提示刚出壳雏鸡感染的细菌有9种,主要有粪肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,为雏鸡胚胎细菌感染的防治奠定了基础。2、为探究粪肠球菌毒力的大小及耐药性,本试验测定了粪肠球菌对鸡胚的半数致死量,并对粪肠球菌做了8类抗生素15种药物的药敏试验。结果发现10倍系列浓度梯度粪肠球菌液,尿囊绒毛膜接种后,鸡胚的存活时间和死亡率呈明显的剂量依赖,粪肠球菌对鸡胚半数致死量为3.03×10~3cfu/mL;药敏试验发现鸡源粪肠球菌对头孢类药物有较强的耐药性,对青霉素和万古霉素较敏感。成功建立了粪肠球菌鸡胚毒力模型,同时筛选出粪肠球菌有效药物。3、为建立一种快速检测鸡源粪肠球菌的方法,参照GenBank中已发表的鸡粪肠球菌全基因组,采用Primer Express 5.0软件设计了一对特异引物,进行了敏感性、特异性、重复性试验,并通过临床组织样品检测评价其临床实用性。结果显示所建立的方法标准曲线线性关系良好,相关系数R~2=0.955;该方法灵敏度高,可检测粪肠球菌的最低限度可达10~1 cfu/mL;特异性强,不与其他鸡源致病菌发生交叉反应;重复性试验中变异系数小于5%,比较稳定。将患雏肝脏组织块提取的DNA作模板,经建立的SYBR GreenⅠLC-PCR方法检测,结果出现了特异性扩增曲线。此方法可用于临床上粪肠球菌的检测。
【图文】：

2-1-1 皮下胶胨样物质 2-1-2 肝脏土黄色 2-1-3 卵黄吸收不良图 2-1 剖检病变Fig.2-1 Biopsy lesion.2 显微镜病变窦状隙明显，充满红细胞（图 2-2-1），肝细胞肿胀，细胞质内有大小不，细胞索紊乱，窦状隙不明显（图 2-2-2）。2-2-1 肝脏充血 2-2-2 水泡变性图 2-2 肝脏 HE 染色 40×Fig.2-2 HE staining of Liver 40×

剖观察到的症状大致相同：皮下有胶胨样物质（图 2-1-1），肝脏呈土-1-2），卵黄吸收不良（图 2-1-3）。2-1-1 皮下胶胨样物质 2-1-2 肝脏土黄色 2-1-3 卵黄吸收不良图 2-1 剖检病变Fig.2-1 Biopsy lesion2 显微镜病变窦状隙明显，充满红细胞（图 2-2-1），，肝细胞肿胀，细胞质内有大小，细胞索紊乱，窦状隙不明显（图 2-2-2）。
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61

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