东方泰勒虫直接PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2020-05-12 10:57

【摘要】：东方泰勒虫(Theileria Oriental)是一种经蜱传播的胞内原生动物寄生虫,在世界范围内广泛分布。该病原体能够引发牛东方泰勒虫病,其主要临床表现为发热、溶血性贫血、生产力下降、乳牛和肉牛的流产或死亡,给养牛业造成了经济损失和危害。目前,血液直接PCR检测方法因其不需要提取DNA而直接应用血液,从而节约时间减少成本故逐渐发展并应用于动物疾病流行病学研究。因此本试验直接以患东方泰勒虫病的牛血液为模板,建立了血液直接PCR检测方法。本文首先根据Genbank上发布的东方泰勒虫p33基因序列[DQ078264.1]设计一对特异性引物,并以血液为模版,采用血液直接PCR反应体系扩增出一条416 bp大小的条带,通过测序得到的核酸序列与基因文库中发表的p33基因进行序列比对同源性高达99%,进而确定该目的片段为p33基因。此外,本试验设计的引物均未能对弓形虫、新孢子虫、牛附红细胞体扩增出目的条带,说明该方法具有良好的特异性。同时,该方法能检测出1μL血液最大稀释倍数为40倍。说明该方法具有良好的敏感性。另外,分别对5份同一批的东方泰勒虫阳性血液样品进行血液直接PCR检测以及常规PCR检测并重复3次试验结果一致说明该方法重复性良好。采集吉林省多个县市共210份疑似牛东方泰勒虫抗凝血进行血液直接PCR检测,与常规PCR法进行比较,确定该方法在诊断检测方面的优势。结果显示,直接PCR总阳性率为30.0%,而常规PCR总阳性率为25.7%,两种方法的符合率为94.0%,一致性分析Kappa值为0.85。阳性符合率为80.0%,阴性符合率为92.0%;通化地区阳性率最高,为75.0%,而洮南地区阳性率最低,为12.0%,不同地区阳性率之间存在统计学差异(P0.05)。该检测结果与胡诗悦等报道的吉林省的牛东方泰勒虫感染率为21.1%～75.9%结果相符。结果表明该方法更值得推广和应用。本试验建立一种简便、快捷、敏感、特异的东方泰勒虫快速检测方法,可适用于东方泰勒虫病的诊断和流行病调查。
【图文】：

泰勒虫,常规,血液

１邋ＰＣＲ扩增逡逑以ＰＩ、Ｐ２为引物，东方泰勒虫阳性血液为模板，进行血液直接ＰＣＲ扩增和逡逑常规ＰＣＲ，得到大小约为４１６ｂｐ的ＤＮＡ片段，与预期目的片段大小一致，如图１。逡逑Ｍ邋１逦２逦３逡逑２０００ｂｐ——＞邋Ｉ逡逑７５０ｂｐ邋逦＞逡逑５００ｂｐ逦＞逦＜——４１６ｂｐ逡逑２５０ｂｐ——＞邋Ｉ邋．邋ｃ邋：》、逡逑图１东方泰勒虫直接ＰＣＲ扩增和常规ＰＣＲ逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｎｄ邋Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ邋Ｏｒｉｅｎｔａｌ逡逑Ｍ：邋ＤＮＡ分子质量标准；１：常规ＰＣＲ结果；２：血液直接ＰＣＲ结果；３：水逡逑对照逡逑Ｍ：ＤＬ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；ｌ：邋Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ邋ＰＣＲ；２：邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＾：逡逑Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋（ｄｄＫｈＯ）逡逑２目的基因的测序及序列分析逡逑将鉴定合格的血液直接ＰＣＲ样品送至上海英骏公司测序后显示，所克隆的逡逑融合基因长为４１６邋ｂｐ，此基因与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的东方泰勒虫ｐ３３基因序逡逑（ＤＱ０７８２６４．１）的同源性为９９％，如图２。逡逑１４逡逑

退火温度,条带,脂糖

脂糖凝胶电泳检测，在４１６邋ｂｐ处出现特异性条带，与预期口的片段大小相同。结逡逑果出现的特异条带在５１．９°Ｃ时条带最亮，故选择５１．９°Ｃ为eA伴退火温度结果，如逡逑图３。逡逑Ｍ１２逦３４逦５６７８逡逑２０００ｂｐ逦＞逡逑７５０ｂｐ邋逦＞逡逑４ｉ６ｂｐ逡逑Ｉ＾＾ＨＩ逡逑图３直接ＰＣＲ退火温度筛选结果逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋Ｄｉｒｅｃｔ邋ＰＣＲ邋ａｎｎｅａｌｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ逡逑Ｍ：ＤＮＡ邋分子质量标准；１邋？８．退火温度：５０邋Ｃ、５０．邋７’Ｃ、５１．邋９邋Ｃ、５３．邋７邋Ｃ、５６．邋１Ｃ、逡逑５８＾Ｃ邋＞邋５９．邋２°Ｃ邋ｘ邋６０邋Ｃ邋；逡逑Ｍ邋：邋１）１，２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１邋？８．邋ａｎｎｅａｌｉｎｇ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５０＂Ｃ、５０．７°Ｃ、５邋１邋．ＶＣ、５３．７°Ｃ、逡逑５６．１°Ｃ
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

【参考文献】