猪肺炎支原体ES-2株的特性研究及猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究

发布时间：2020-05-12 10:20

【摘要】：猪呼吸道疾病是制约世界各地集约化养猪业快速发展的重要疾病之一。其中猪肺炎支原体是引起各国养殖业中猪的地方流行性呼吸道疾病气喘病的主要病原,气喘病作为一种发病率高和致死率低的慢性呼吸道疾病,主要引起猪慢性干咳、生长缓慢和对饲料利用率降低。自上个世纪三十年代该病首次被德国科学家报道以来,猪气喘病已经给世界各地养猪业造成严重的经济损失。在实际生产中,感染猪肺炎支原体的猪更容易继发感染细菌性病原,从而给养猪业造成更大的经济损失。猪链球菌2型是一种危害极大的人兽共患病病原体,能够感染人和猪,引起肺炎和脑膜炎。在当前养猪业中,猪链球菌2型经常继发感染患有支原体肺炎的保育猪肺组织,在猪链球菌2型与猪肺炎支原体的混合感染下,使保育猪的呼吸道疾病变得复杂多变,荚膜多糖在猪链球菌2型的致病过程中扮演重要角色,其中荚膜多糖的合成需要多个基因共同参与。本研究针对猪的复杂呼吸道疾病等科学问题,开展了对猪肺炎支原体的分离和培养工作;通过第三代测序技术完成了对新分离株的全基因组测序和组装,通过比较基因组学挖掘了其特有致病相关因子及致病性猪肺炎支原体的共有基因;通过动物实验评估了新分离野生株作为疫苗对猪的免疫保护效果。针对被预测参与荚膜多糖重复糖单元合成的4个基因(cps2E、cps2G、cps2J和cps2L),通过基因缺失及生物学特性研究,确定了其在猪链球菌2型荚膜多糖合成中的作用。主要研究结果如下:1.猪肺炎支原体ES-2株的分离培养及致病性研究本研究采用了一种多点取样连续传代的方法,并通过使用Friis培养基成功从湖北恩施黑猪肺组织中分离出猪肺炎支原体,并将其命名为猪肺炎支原体ES-2株。ES-2株在改良Friis培养基中培养至48h左右,其生长滴度最高可达到1×10~(10)CCU/mL,在固体平板上呈“煎蛋样”形态。ES-2细胞呈圆形或卵圆形,其直径在0.2-1.6μm之间,对卡那霉素(MIC=2μg/mL)最敏感。动物实验结果显示,猪肺炎支原体ES-2株对宿主具有高致病性,引起猪肺部出现典型的支原体肺炎“肉变”,支气管上皮细胞的纤毛分叉、变短甚至脱落等病变。在通过气管感染不同剂量猪肺炎支原体ES-2株(7×10~6 CCU、7×10~7 CCU、7×10~8 CCU和7×10~9 CCU)的感染组中,其中攻毒剂量为7×10~7 CCU的感染组发病率最高且病变最严重。2.猪肺炎支原体ES-2株的全基因组特征及比较基因组学分析本研究通过第三代测序PacBio方法完成对ES-2株全基因组的测序与组装,通过起始位点校正绘制了ES-2株基因组完成图,利用生物信息学工具预测基因组的ORFs,并进一步利用蛋白质数据库NCBI NR和UNIPORT对ORFs进行注释,利用COG数据库对注释的蛋白进行分类,通过与VFDB数据库比对挖掘其毒力因子。通过将ES-2株全基因组与从NCBI收集的161株分离自不同宿主的支原体全基因组做进化树分析,亲缘关系显示ES-2株与已报道的另外8株猪肺炎支原体、1株猪絮状支原体和2株牛差异霉形体位于同一个分支,同猪鼻支原体的亲缘关系较近,与人肺炎支原体的亲缘关系最远。为了挖掘出致病性猪肺炎支原体的共有基因,本研究利用BlASTP比较了致病性(ES-2、168、7422和7448)和非致病性(J)猪肺炎支原体的全基因组,通过设置不同的相似度(0.75、0.80、0.85、0.90、0.95和0.99),初步筛选出34个致病性猪肺炎支原体的共有基因。通过进一步比对分析,最终在氨基酸和核苷酸水平上,只鉴别出一个致病性猪肺炎支原体的共有基因(ES-2_00484)。3.猪肺炎支原体ES-2株对猪的免疫保护效果研究本研究基于猪肺炎支原体ES-2株具有生长滴度高且生长速度快的优点,将其制备成猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗,通过给仔猪免疫接种不同剂量的猪肺炎支原体ES-2株灭活疫苗来评估该灭活疫苗的最佳免疫保护剂量。免疫保护结果显示1.6×10~9 CCU/头份的ES-2株免疫剂量对猪的免疫保护效果最佳,1.6×10~7CCU/头份和1.6×10~8 CCU/头份的ES-2株免疫剂量能达到与商业猪肺炎支原体灭活疫苗(1.6×10~8 CCU/头份)对猪同等的免疫保护效果。4.猪链球2型菌荚膜多糖合成相关基因的研究本研究通过同源重组方法成功将4个基因(cps2E、cps2G、cps2J和cps2L)分别从猪链球菌2型中缺失,构建了4个荚膜多糖单基因缺失株(Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J和Δcps2L)。实验结果显示,由于基因cps2E、cps2G、cps2J或cps2L的缺失,导致猪链球菌2型表面的荚膜多糖严重缺失,而且荚膜多糖中的唾液酸含量显著下降。体外和体内实验结果显示,荚膜多糖缺失突变株Δcps2E、Δcps2G、Δcps2J或Δcps2L与宿主的相互作用发生明显变化,对小鼠动物模型的致病能力显著下降。总之,本研究证实了基因cps2E、cps2G、cps2J和cps2L参与了猪链球菌2型细胞表面荚膜多糖的合成,并且进一步的研究表明这些基因在猪链球菌2型对宿主的入侵及定殖过程中发挥重要作用。
【图文】：

猪肺炎支原体

肺炎支原体细胞呈圆形或椭圆形，其直径介于 0.5-0.8 μm 之间（图 1-1）异性感染猪，是引起猪呼吸道疾病的重要病原之一（Tajima et al 1nchard et al 1992）。而且临床分离的不同猪肺炎支原体野生株在致病能呈现出多样性（Vicca et al 2003, Villarreal et al 2009）。

模式图,猪肺炎支原体,模式图,纤毛

需在多种表面蛋白（P97、P102、P116、P135、P159 和 P216）和宿主细胞相互作用下完成（图1-2）。随后猪肺炎支原体导致被黏附的纤毛生长停滞、聚集成簇直至脱落，严重的则可导致纤毛上皮细胞脱落（Jericho et al 1986）（图 1-3）。目前关于猪肺炎支原体引起纤毛损伤的机制很少，有研究报道致病性猪肺炎支原体跟纤毛的黏附刺激了气管细胞内质网中钙离子的释放，并认为钙离子调控的信号通路与上皮细胞纤毛的脱落有关（Seung-Chun et al 2002）。纤毛活性的损坏或缺失一旦出现，，就会导致呼吸道第一道防御屏障黏膜系统清除能力的减弱，使得猪肺炎支原体在呼吸道内进一步增殖从而引起更严重的感染。图 1-2 猪肺炎支原体感染宿主的模式图（Tao et al 2019）Fig 1-2 A schematic representation of infection by M. hyopneumoniae
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.6

【参考文献】