NEFAs激活NF-κB-Orai1信号通路介导犊牛肝细胞脂肪酸从头合成的调控机制

发布时间：2020-05-13 01:28

【摘要】：围产期奶牛脂肪肝病是一种重要的奶牛营养代谢性疾病,它常发于围产期的高产奶牛,其发病原因是围产期的奶牛采食量下降,泌乳需求上升,泌乳高峰早于采食高峰导致机体发生能量负平衡,使脂肪动员产生能量来供给机体泌乳需要,而脂肪动员生成的大量非酯化脂肪酸(NEFAs)运输到肝脏,在肝脏合成了大量的甘油三酯(TG),远远超过了肝脏能够以极低密度脂蛋白(VLDL)形式输出的量,从而导致了大量TG在肝脏蓄积。围产期奶牛脂肪肝病降低了奶牛的采食量与产奶量,损害了奶牛的繁殖能力和免疫功能,降低了牛奶的质量,提高了奶牛患各种产后疾病的风险及奶牛的淘汰率,每年都会给养牛业造成一笔巨大的经济损失。为探究NEFAs对奶牛脂肪酸从头合成调控因子的影响,在奶牛脂肪肝病发展中的作用,以及探究Ca~(2+)相关的NF-κB-Orai1信号通路是否在NEFAs介导的奶牛脂肪酸从头合成调节过程中有所参与,本研究通过体外培养犊牛原代肝细胞,添加NEFAs刺激细胞,并加入NF-κB抑制剂Wogonin与Orai1抑制剂2-APB,通过检测细胞内Ca~(2+)浓度的变化,脂肪酸从头合成相关调控因子SREBP-1c、ACC1和FAS的表达调控,以及观测细胞脂滴生成情况,来综合评价NEFAs在奶牛脂肪肝病发生发展中的影响,并通过细胞沉默实验,验证了Orai1信号通路在奶牛脂肪酸从头合成过程中的参与作用。胞内Ca~(2+)流式细胞术检测结果显示,随着NEFAs刺激时间的延长,胞内Ca~(2+)浓度在不断升高,刺激3 h与刺激12 h时的胞内Ca~(2+)与0 h相比差异显著(p0.05),刺激6 h与刺激9 h时胞内Ca~(2+)与0 h相比差异极显著(p0.01)。QRT-PCR检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平的结果显示,NEFA组的NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著高于control组(p0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的NF-κB p65、Srebp-1c的mRNA表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),Orai1、Fas、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的Fas的mRNA表达水平显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65、Orai1、Srebp-1c、Acc1的mRNA表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01)。Western Blot方法检测犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、ORAI1、SREBP-1、FAS、ACC1的蛋白表达水平的结果显示,NEFA组的ORAI1、ACC1的蛋白表达水平均显著高于control组(p0.05),NF-κB p65、SREBP-1、FAS的蛋白表达水平均极显著高于control组(p0.01);经2-APB试剂预处理的NEFA组的ORAI1、SREBP-1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65、FAS、ACC1的蛋白表达水平均极显著低于NEFA组(p0.01);经Wogonin试剂预处理的NEFA组的FAS、ACC1的蛋白表达水平均显著低于NEFA组(p0.05),NF-κB p65的蛋白表达水平极显著低于NEFA组(p0.01)。激光共聚焦荧光检测犊牛原代肝细胞脂滴生成情况结果显示,犊牛原代肝细胞不同处理下NF-κB p65、Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的脂滴生成水平有所差异,NEFA组的脂滴生成水平极显著高于control组(p0.01);经2-APB、Wogonin试剂预处理的NEFA组的脂滴生成水平均显著低于NEFA组(p0.05)。沉默Orai1基因可见Orai1、SREBP-1c、FAS、ACC1的mRNA与蛋白表达水平都有了显著下调(p0.05)。NF-κB能够调控奶牛体内Orai1信号通路,刺激细胞Ca~(2+)内流,参与调节肝脏脂肪酸从头合成调控因子表达水平上调,使肝脂合成增多,从而提高了围产期奶牛患脂肪肝病的风险。本实验对于围产期奶牛脂肪肝的发生机制研究、预防和诊治具有重要的意义,对Orai1通路的研究或可开启围产期奶牛脂肪肝病药物治疗研发的新道路。
【图文】：

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结果与分析结果与分析犊牛原代肝细胞发生肝脂沉积时细胞内 Ca2+浓度的差异变化为探究高浓度 NEFAs 对围产期奶牛细胞内外 Ca2+交换的影响，我们利用犊牛原加高浓度 NEFAs 模拟围产期奶牛肝脏环境，检测犊牛原代肝细胞在不同刺激时a2+浓度的变化并分析。结果如图 3-1 所示，，随着 NEFAs 刺激时间的延长，胞内在不断升高，刺激 3 h 与刺激 12 h 时的胞内 Ca2+与 0 h 相比胞内 Ca2+浓度显著<0.05），刺激 6 h 与刺激 9 h 时胞内 Ca2+浓度与 0 h 相比差异极显著上升（p<0.0

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NEFAs 激活 NF-κB-Orai1 信号通路介导犊牛肝细胞脂肪酸从头合成的调控机制沉默 Orai1 信号通路后犊牛原代肝细胞脂肪酸从头合成调控白表达水平的差异变化为探究 Orai1 是否参与调控围产期奶牛脂肪酸从头合成，我们沉默了rai1 基因，通过检测犊牛原代肝细胞脂肪酸从头合成相关调控因子的1 信号通路是否参与了围产期奶牛脂肪酸从头合成过程中。图 3-2、图肝细胞沉默了 Orai1 基因之后，脂肪酸从头合成相关调控因子 SREBP-RNA 与蛋白表达水平结果。由图 3-2、图 3-3 可见，siOrai1 组的 Ora、ACC1 的 mRNA 与蛋白的表达水平与 siN 组相比都有显著的下调（
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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