波形蛋白在牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞时的作用研究

发布时间：2020-05-13 08:19

【摘要】：牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea,BVD)是严重危害养牛业的重要传染病之一。研究病毒对宿主的感染机制有助于该病的防控。本实验室前期筛选出4种可能与BVDV存在相互作用、最具有后续研究价值的互作蛋白,分别是波形蛋白、α-辅肌动蛋白、肌动蛋白和微管蛋白。有大量的研究表明,波形蛋白在许多病毒的感染中发挥着重要的作用。本研究拟确定波形蛋白在BVDV感染MDBK细胞时的作用,该研究对于深入了解BVDV的感染机制具有重要的理论价值。本研究首先确定BVDV感染是否对MDBK细胞的波形蛋白产生影响,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测BVDV感染后MDBK细胞中波形蛋白的转录水平,Western blot检测波形蛋白的水平。结果表明:在BVDV感染早期,MDBK细胞中波形蛋白的转录和蛋白量明显降低。激光共聚焦检测确定波形蛋白与BVDV结构蛋白E2共定位。推测在BVDV侵染过程中与波形蛋白发生了作用。其次,为了确定破坏和敲低波形蛋白对BVDV感染MDBK时病毒复制的影响。采用短发夹RNA介导的RNA干扰技术,设计构建靶向波形蛋白的特异shRNA质粒,利用shRNA敲低MDBK细胞中波形蛋白的表达,利用ACY破坏波形蛋白结构,然后感染BVDV,确定破坏和敲低波形蛋白对病毒复制的影响。结果表明,成功构建了3组靶向波形蛋白的特异shRNA质粒,均敲低了MDBK的内源性波形蛋白的表达。在MDBK细胞上波形蛋白被敲低或破坏时,均影响了BVDV的复制,降低了病毒滴度。为了进一步研究重组波形蛋白和波形蛋白单抗阻断对BVDV感染MDBK时病毒复制的影响。PCR扩增波形蛋白基因,构建Vim-pET-28a表达质粒,诱导表达,镍柱纯化目的蛋白。分别应用重组波形蛋白和波形蛋白单抗铺覆MDBK细胞,检测BVDV感染MDBK时病毒复制情况。结果表明,成功获得原核表达的波形蛋白。重组波形蛋白和波形蛋白单抗阻断均对BVDV的早期复制产生影响,明显降低了病毒滴度。综上所述,BVDV感染抑制了MDBK中波形蛋白的转录与表达。波形蛋白被敲低或破坏后,BVDV的复制水平下降。重组波形蛋白和波形蛋白单抗阻断后,均影响了BVDV的复制,降低了病毒滴度。BVDV感染MDBK细胞时波形蛋白与病毒的复制具有相关性。本研究有助于揭示BVDV的感染机制,对于BVDV的防控奠定了基础。
【图文】：

氧化物酶偶联的羊抗鼠的二抗于平稳匀速次清洗时间不少于15 min。根据DAB-H2 E2蛋白和波形蛋白进行共定位中生长到60-70%，吸去培养液，，PBS洗3三次，弃上清，加入4%多聚甲醛，室温00通透，加入含1%牛血清白蛋白封闭1 h%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见244 bp的

图2-2.接毒后不同时间段波形蛋白mRNA表达量.Vimentin mRNA expression at different time after infectioern blot结果染BVDV 24h时，波形蛋白的定量Western blot结明显减少。图2-3 .BVDV感染24h时对波形蛋白的影响Fig 2-3.BVDV infection 24h on vimentinDV E2蛋白的共定位
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

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本文编号：2661660