西农萨能奶山羊乳腺α-S1-酪蛋白基因功能的初步研究

发布时间：2020-05-13 12:38

【摘要】：αs1-酪蛋白(Alpha S1 Casein,CSN1S1)是乳蛋白中一种重要的蛋白质,可以为动物体的生长发育提供活性肽、必需氨基酸等营养物质,也能够调节乳腺上皮细胞等多种细胞的生理状态及功能。因此,探究αs1-酪蛋白基因对奶山羊乳蛋白合成的调控作用有极其重要的意义。本研究通过克隆得到奶山羊CSN1S1基因的CDS区,并构建了CSN1S1基因重组腺病毒过表达载体,同时在线设计并合成靶向CSN1S1基因的特异性siRNA。在山羊乳腺上皮细胞中分别对CSN1S1基因进行过表达和干扰,通过RT-qPCR和Western Blot等方法检测乳蛋白相关基因表达量及部分乳蛋白表达量的变化,为进一步明确αs1-酪蛋白基因在乳蛋白合成中的功能奠定一定的理论基础。以下为本研究主要结果:1.采集泌乳盛期西农萨能奶山羊乳腺组织,提取总RNA,根据GenBank中收录的Capra hircus的CSN1S1基因序列(KT253650.1)来设计引物,利用RT-PCR技术克隆得到山羊CSN1S1基因CDS序列,其长度为642bp,编码213个氨基酸。生物信息学分析得出,山羊CSN1S1基因CDS区序列与Ovis aries(FJ440845.1)、Bos taurus(EU908730.1)、Mus musculus(AF275367.1)、Sus scrofa(NM_001004029.2)、Homo sapiens(NM_001890.2)的同源性分别为:98.91%、97.83%、84.87%、92.52%以及85.69%。2.构建含目的基因的同源重组质粒pAdEasy-CSN1S1,转染293A细胞,感染扩增四代得到高滴度腺病毒,滴度为10~8 U/mL。通过不同体积的病毒液感染山羊乳腺上皮细胞,确定病毒最佳感染复数(MOI)为200。病毒感染山羊乳腺上皮细胞48 h后收集细胞总RNA或总蛋白,RT-qPCR结果显示,CSN1S1基因表达量显著上调(P0.01),CSN2基因表达显著下调(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG的表达水平无显著变化;Western blot结果显示,过表达CSN1S1基因后,αs1-酪蛋白表达量显著升高(P0.05),β-酪蛋白表达量显著下降(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白表达水平无显著变化。3.根据CSN1S1基因CDS区序列,设计靶向CSN1S1基因的特异性siRNA,并转染山羊乳腺上皮细胞,筛选得到干扰效率最佳的siR-507(P0.01)。干扰CSN1S1基因后,RT-qPCR结果显示,CSN2基因表达水平显著上调(P0.05),CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG基因的mRNA水平无显著变化;Western blot结果显示,αs1-酪蛋白表达量被抑制(P0.05);β-酪蛋白表达水平显著上调(P0.05),αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白的表达无明显变化。综上所述,本研究成功克隆得到了奶山羊αs1-酪蛋白基因的CDS区,构建了腺病毒过表达载体,并感染山羊乳腺上皮细胞以过表达CSN1S1基因,可导致CSN2基因的mRNA表达水平及蛋白表达显著下调,干扰αs1-酪蛋白基因能够显著上调CSN2基因及β-酪蛋白表达。本研究为明确CSN1S1基因在西农萨能奶山羊乳腺细胞乳蛋白合成中的调控作用提供理论依据。
【图文】：

腺泡,干奶期,乳腺,泌乳期

乳腺是一个高度组织化的器官，通过它向母体提供营养物质，对于动物机体生长、育和健康至关重要。乳腺是哺乳动物体内特殊的腺体，具有特殊的泌乳功能，乳腺育和哺乳动物产生的泌乳行为是其重要特征，乳腺属于外分泌腺体，由哺乳动物皮中的汗腺衍生而来(Antonio J et al. 2017)。在乳的形成过程中，腺泡承担着重要任务，泡是泌乳的最基本结构，在乳腺中存在大量的腺泡，它是由乳腺上皮细胞构成，单乳腺上皮形成了中空的腔体，这个空腔被称为腺泡腔，在泌乳过程中，它将各种营物质转化成乳(张倡珲等 2017)。卵巢激素促进乳腺的生长，乳腺在卵巢素的作用下始发育，青春期的腺泡上皮细胞最初排列紧密，到泌乳期后，腺泡变得饱满，胞质盈，胞间质减少(Bai G et al. 2016)，，形态变化如图 1.1 所示，而到了干奶期，腺泡也小，胞间质会增多。乳腺腺泡的发育从青春期经历腺泡芽、初级腺泡、成熟腺泡三阶段，其中的单层分泌细胞也就是乳腺上皮细胞，是腺泡中用以分泌乳汁的，也就泌乳的最基本单位(Liu Y et al. 2010)。

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泌乳山羊来说，泌乳细胞会在分娩期和泌乳高峰期内大量的增殖，泌乳会降低，分析原因可能是因为乳腺分泌组织的萎缩从而导致细胞凋亡，低。乳腺细胞不仅能够合成非必需氨基酸，还能提供合成乳蛋白所ky L et al. 2017)。乳腺合成的乳蛋白进入动物机体循环系统的很少，基本程，从终导管排出体外。对动物静脉注射特异性蛋白标记的氨基酸（1行测定，对乳腺进行动静脉差的测定等研究都能够证明，酪蛋白、α-乳清蛋白等都是由乳腺分泌细胞利用血液中的氨基酸或小肽从头合成的(Chi6)。编码乳蛋白的相关基因表达具有明显组织特异性和一定的阶段特异性的合成在乳腺上皮细胞中特定进行，表达量大，并且发生在相当长一段内，即哺乳母体即将分娩前后的时那段时期(Bohl M et al. 2016)。乳蛋白达效率和组织特异性主要是由顺式作用元件包括一些启动子、增强子、位点控制区等以及与顺势元件相结合的反式作用因子，例如转录因子和所决定。有关乳蛋白质基因结构研究及其表达调控的相关研究已取得巨蛋白基因,如牛的各种酪蛋白基因、α-乳清蛋白基因（LALBA）、β-乳球蛋白（被克隆得出，并得到了全部序列(ALFEREZ et al. 2001)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827

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