我国不同基因亚型新发PRRSV的生物学特性分析及标记疫苗的研究
发布时间：2020-05-14 03:49
【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原。九十年代初期,I型和II型PRRSV几乎同时在欧洲和北美出现。1996年,中国大陆首次分离到PRRSV。经过二十多年的演化,PRRSV的多样性更加复杂。为了了解我国不同基因亚型新发PRRSV的流行情况和生物学特性,本研究在2014-2018年从全国14个省市疑似PRRSV感染的1900份病料中检测分离PRRSV。本研究共测定了321株PRRSV的ORF5基因和50株PRRSV的全基因组序列,鉴定了5种类型的PRRSV,分别是NADC30-like PRRSV(Sublineage 1.8)、NADC34-like PRRSV(1-7-4,Sublineage 1.5)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage 3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage 5.1)和Sublineage 8.7 PRRSV,其中NADC34-like PRRSV是首次在中国发现。本章节主要完成了以下6个内容:(1)本研究根据Shi et al(2010)的报道,进一步将Lineage 1 PRRSV分为9个Sublineage(1.1-1.9),NADC30-like PRRSV属于Sublineage 1.8。Sublineage 1.8 PRRSV具有更快的变异速度和更高的重组频率,毒株之间的基因组同源性较低,重组模式复杂多样,重组的位置主要集中于非结构蛋白区和次要结构蛋白区。(2)2017年,本研究首次分离到2株Nsp2蛋白存在100个aa连续缺失的新毒株LNWK96和LNWK130,2株毒株均为重组病毒,遗传演化分析显示,该类毒株属于Sublineage 1.5,它们与美国流行的NADC34毒株同源性最高,也被称为NADC34-like PRRSV或1-7-4分支PRRSV,它们可能起源于北美。(3)本研究对Lineage 3 PRRSV进一步分类,分为Sublineage 3.1-3.5,Sublineage 3.5 PRRSV具有较高的重组频率,与本地毒株重组后广泛存在于我国的南方地区。通过对过度毒株FJ-1和FJFS的遗传演化分析,证实了大陆地区的Sublineage 3.5 PRRSV起源于台湾地区的Sublineage 3.2。(4)Lineage 5 PRRSV疫苗在我国应用较早,我国分离的Lineage 5 PRRSV均属于Sublineage 5.1,它们与ATCC VR2332和疫苗株RespPRRS MLV具有较高的核苷酸同源性。Sublineage 5.1 PRRSV在我国变异较小,这类毒株的出现可能和疫苗的应用有关。(5)本研究将Sublineage 8.7 PRRSV进一步分为Sublineage 8.7.1(CH-1a like PRRSV)、Sublineage 8.7.2(HP-PRRSV like PRRSV)和Sublineage 8.7.3(HP-PRRSV),2006年以后,HP-PRRSV席卷全国各省,然而,近年来Sublineage 8.7.3 PRRSV已经发生较大变异,这类毒株的致病性和当前疫苗的保护效果尚不清楚(6)Sublineage 1.8 PRRSV是我国新出现的PRRSV,而且在短时间内已经成为我国的主要流行毒株,本研究对Sublineage 1.8 PRRSV SD53-1603株进行了致病性和免疫保护效果评估,结果表明SD53-1603株对猪只具有中等致病性,当前商品化疫苗HuN4-F112可以提供一定程度的保护。为了寻找PRRSV的遗传演化规律,本研究对相对封闭的大型养殖集团进行了长达4年的PRRSV监测,从该大型养殖集团的不同猪场共采集了338份疑似PRRSV感染的组织或血清,鉴定并测序了119株PRRSV的ORF5序列和34株PRRSV的全基因组序列。鉴定了4种类型的PRRSV存在于该大型养殖集团,分别是NADC30-like PRRSV(Sublineage 1.8)、QYYZ-like PRRSV(Sublineage 3.5)、RespPRRSV MLV like PRRSV(Sublineage 5.1)和HP-PRRSV(Sublineag 8.7)。发现当前如此复杂的重组模式是逐步形成的,同一毒株在不同的位置发生重组,增加重组的多样性,为病毒的生存提供更多的可能。该集团RespPRRS MLV like PRRSV是RespPRRS MLV疫苗的返强毒株,确定了5个毒力相关位点和4个返强相关位点。大型养殖集团内PRRSV的分布和传播与猪只的运输关系和疫苗的使用密切相关。弱毒疫苗是防控PRRS的主要方法之一,但目前使用PRRS活疫苗的缺陷是疫苗株抗体不能与野毒株抗体有效区分,不利于疫苗免疫效果的评价和疫病的净化。为了解决这一难题,在本实验室已建立的针对M蛋白(1C8表位)的阻断ELISA抗体监测方法基础上,本研究构建了NADC30-like PRRSV SD53-1603株的感染性克隆,并成功拯救出子代病毒。运用该感染性克隆平台,构建了12种M蛋白1C8表位aa缺失或替换的缺陷型质粒,通过病毒拯救,成功获得5种缺失病毒。经过体外验证后,将这5种缺陷型病毒传至65代进行免疫实验,实验结果表明,rSD53-1603-Δ3SΔ4S-M65与母本毒株rSD53-1603-M65产生针对1C8表位的特异性抗体差异极显著,以上结果为PRRSV DIVA疫苗的研制奠定了基础。
【图文】：
中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言ORF7 的下游，大约 150 nt。3’UTR 同样具有遗传多样性，I 型和 II 型 PRRSV 3’UTR 的 nt同源性大约为 70 %，而同一基因型的 3’UTR nt 同源性大约为 96 % (Beerens et al., 2007; Choiet al., 2006; Verheije et al., 2002; Yin et al., 2013)。5’UTR 的下游是 1 个大的编码复制酶的 ORF。ORF1a/b 有 1 个共同的翻译起点，但是存在 2 个核糖体移码位点 (Ribosomal frame- shift，RFS)，分别位于 nsp2 基因的 3,889 nt 处(RFS1)和nsp8/9的7,695 nt (RFS2) 处 (参考毒株为VR-2332) (Fang et al., 2012; Li et al., 2015;Meulenberg et al., 1993b)。在 RFS1 位点产生 2 个蛋白，分别是 Nsp2N (-1 RFS, ~7 % 的效率)(Li et al., 2014a) 和 Nsp2TF (-2 RFS, ~20 % 的效率) (Fang et al., 2012)。复制酶多聚蛋白通过RFSs 加工成至少 16 个 Nsps，其中 4 个具有蛋白酶活性，包括木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶 (Papain-like cysteine proteinases, PLP1α, PLP1β 和 PLP2)和丝氨酸蛋白酶 (Serineproteinase, SP) (Snijder et al., 2013)。PLP1α 和 PLP1β 的功能是分别切割 Nsp1α/Nsp1β 和Nsp1β/Nsp2 的连接处 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。PLP2 的功能是切割 Nsp2/Nsp3的连接处 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。SP负责切割剩下的Nsps (Nsp3~12) (Han et al.,2009; Snijder et al., 2013)。ORF1a 编码多聚蛋白 pp1a，进一步加工形成 Nsp1α/β、Nsp2~6、Nsp7α/β 和 Nsp8 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。ORF1b 编码多聚蛋白 pp1ab，进一步加工形成 Nsp9~12 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。
35 SX2-1607 2016.07.28 Shanxi 76 XNF40-1809 2018.09.03 Guangdong36 TZJ11-1707 2017.07.28 Jilin 77 XNF41-1809 2018.09.03 Guangdong37 TZJ12-1707 2017.07.28 Jilin 78 XNF86-1803 2018.03.27 Guangdong38 TZJ31-1711 2017.11.14 Heilongjiang 79 XNF9-1804 2018.04.14 Guangdong39 WK101b-1711 2017.11.08 Liaoning 80 ZD11-1810 2018.10.10 Heilongjiang40 WK102b-1711 2017.11.08 Liaoning 81 ZD13-1810 2018.10.10 Heilongjiang41 WK108a-1711 2017.11.29 Liaoning 82 ZD14-1810 2018.10.10 HeilongjiangaPRRSV could be isolated from PAM and Marc-145 cells;bPRRSV could be isolated from PAM cells2.3.2.2 NADC30-like PRRSV 的遗传演化分析2012 年，NADC30-like PRRSV 在中国首次被检测到 (周峰等，2014)，直到 2016 年，，大量的毒株在中国各大猪场出现。与中国存在的 HP-PRRSV 不同，NADC30-like PRRSV 具有更复杂的多样性和更多样的重组模式。本研究对 GenBank 中所有的中国分离的 NADC30-like PRRSV 和本研究检测到的 82 株 NADC30-like PRRSV 进行遗传演化分析，发现 2016-2018 年间，本研究检测到的 NADC30-like PRRSV 遍布整个 Sublineage 1.8 分支，Sublineage 1.8 分支用灰色背景显示，本研究中检测到的 NADC30-like PRRSV 用红色显示 (图 2.2)。当前该分支的 diversity 是 7.6 %，这与报道的 NADC30-like PRRSV 复杂的遗传多样性相吻合。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
本文编号：2662730
【图文】：
中国农业科学院博士学位论文 第一章 引言ORF7 的下游，大约 150 nt。3’UTR 同样具有遗传多样性，I 型和 II 型 PRRSV 3’UTR 的 nt同源性大约为 70 %，而同一基因型的 3’UTR nt 同源性大约为 96 % (Beerens et al., 2007; Choiet al., 2006; Verheije et al., 2002; Yin et al., 2013)。5’UTR 的下游是 1 个大的编码复制酶的 ORF。ORF1a/b 有 1 个共同的翻译起点，但是存在 2 个核糖体移码位点 (Ribosomal frame- shift，RFS)，分别位于 nsp2 基因的 3,889 nt 处(RFS1)和nsp8/9的7,695 nt (RFS2) 处 (参考毒株为VR-2332) (Fang et al., 2012; Li et al., 2015;Meulenberg et al., 1993b)。在 RFS1 位点产生 2 个蛋白，分别是 Nsp2N (-1 RFS, ~7 % 的效率)(Li et al., 2014a) 和 Nsp2TF (-2 RFS, ~20 % 的效率) (Fang et al., 2012)。复制酶多聚蛋白通过RFSs 加工成至少 16 个 Nsps，其中 4 个具有蛋白酶活性，包括木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶 (Papain-like cysteine proteinases, PLP1α, PLP1β 和 PLP2)和丝氨酸蛋白酶 (Serineproteinase, SP) (Snijder et al., 2013)。PLP1α 和 PLP1β 的功能是分别切割 Nsp1α/Nsp1β 和Nsp1β/Nsp2 的连接处 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。PLP2 的功能是切割 Nsp2/Nsp3的连接处 (Han et al., 2009; Snijder et al., 2013)。SP负责切割剩下的Nsps (Nsp3~12) (Han et al.,2009; Snijder et al., 2013)。ORF1a 编码多聚蛋白 pp1a，进一步加工形成 Nsp1α/β、Nsp2~6、Nsp7α/β 和 Nsp8 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。ORF1b 编码多聚蛋白 pp1ab，进一步加工形成 Nsp9~12 (Meulenberg et al., 1993b; Nelsen et al., 1999)。
35 SX2-1607 2016.07.28 Shanxi 76 XNF40-1809 2018.09.03 Guangdong36 TZJ11-1707 2017.07.28 Jilin 77 XNF41-1809 2018.09.03 Guangdong37 TZJ12-1707 2017.07.28 Jilin 78 XNF86-1803 2018.03.27 Guangdong38 TZJ31-1711 2017.11.14 Heilongjiang 79 XNF9-1804 2018.04.14 Guangdong39 WK101b-1711 2017.11.08 Liaoning 80 ZD11-1810 2018.10.10 Heilongjiang40 WK102b-1711 2017.11.08 Liaoning 81 ZD13-1810 2018.10.10 Heilongjiang41 WK108a-1711 2017.11.29 Liaoning 82 ZD14-1810 2018.10.10 HeilongjiangaPRRSV could be isolated from PAM and Marc-145 cells;bPRRSV could be isolated from PAM cells2.3.2.2 NADC30-like PRRSV 的遗传演化分析2012 年，NADC30-like PRRSV 在中国首次被检测到 (周峰等，2014)，直到 2016 年，，大量的毒株在中国各大猪场出现。与中国存在的 HP-PRRSV 不同，NADC30-like PRRSV 具有更复杂的多样性和更多样的重组模式。本研究对 GenBank 中所有的中国分离的 NADC30-like PRRSV 和本研究检测到的 82 株 NADC30-like PRRSV 进行遗传演化分析，发现 2016-2018 年间，本研究检测到的 NADC30-like PRRSV 遍布整个 Sublineage 1.8 分支，Sublineage 1.8 分支用灰色背景显示，本研究中检测到的 NADC30-like PRRSV 用红色显示 (图 2.2)。当前该分支的 diversity 是 7.6 %，这与报道的 NADC30-like PRRSV 复杂的遗传多样性相吻合。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
本文编号：2662730
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