小反刍动物慢病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立和初步应用

发布时间：2020-05-13 22:04

【摘要】：小反刍动物慢病毒(SRLV)是山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)和梅迪-维斯纳病毒(MVV)的统称,主要引起山羊和绵羊的慢性持续性感染,表现为山羊的关节炎、脑脊髓炎和绵羊的间质性肺炎等。这两种病毒感染具有一定的宿主特异性,即CAEV多感染山羊,而MVV倾向于感染绵羊。但近年来的分子流行病学调查发现,其可跨种感染,并且基于病毒pol-gag基因序列可分为A、B、C、D和E五个亚群,当前建立的病原分子生物学检测方法仅适用于部分基因亚群毒株的检测,因而建立通用的CAEV和MVV核酸检测方法极为必要。本研究对GenBank公布的31株SRLV前病毒基因组序列进行比对,筛选出vif基因上约150bp的序列作为诊断标记物并设计简并引物,通过全基因合成方法获得该序列作为PCR反应的阳性对照模板,以此建立了SRLV通用PCR检测方法;在此基础上,使用SYBR Green I染料建立实时荧光定量RT-PCR方法。为验证建立的病原分子生物学检测方法,进行CAEV人工感染动物试验,并于感染前70天、10天;感染后第4天、8天、15天、23天、28天、42天、58天、71天、84天、99天、113天采集5mL的抗凝血。每次采血后,在72小时内,取1mL全血提取总DNA进行CAEV前病毒DNA的检测;随后,将抗凝血离心后取200μL的血浆用于提取病毒的RNA并反转录为cDNA,使用PCR和实时荧光定量RT-PCR方法来检测病原及其载量,并使用IDEXX SRLV抗体筛查试剂盒检测血清抗体。此外,采集了2017-2018年间新疆乌鲁木齐县、阿克苏、乌苏、巴楚县、富蕴县等地区的165只山羊样本进行抗体检测和病原学检测。研究结果表明筛选的位于SRLV vif基因上的150bp序列可作为其通用诊断标识物,建立的通用PCR检测方法,其敏感性为10~3个分子拷贝数,并初步证实其可用于CAEV和MVV野毒株RNA和前病毒DNA的检测;使用SYBR Green I染料建立的实时荧光定量RT-PCR方法其敏感性不低于100个分子拷贝数,线性范围为10~2-10~7分子拷贝数,且可用于CAEV动物感染的检测,较感染抗体被检出的时间提前。此外,在乌苏县和巴楚县分别检出25%和20%的CAEV血清学阳性样本,新疆地区CAEV血清学阳性率为2.4%,再次证实新疆有该病的流行。该研究建立的方法有望用于我国SRLV的病原学检测,并提示新疆地区有必要开展大范围的CAEV流行病学调查以掌握其流行情况、制订防控方案。
【图文】：

分布情况,慢病毒,分布情况,病毒

图 1 我国小反刍动物慢病毒的分布情况Fig.1 Distribution of small ruminant lentiviruses in China除新疆、四川是 CAEV 和 MVV 共同分布的地区，其余为 CAEV 分布的地区。理化、分子生物学特征理化特征炎-脑炎病毒属于逆转录病毒科、慢病毒亚科，是有囊膜的单股，直径大小为 70-100nm。CAEV 对外界环境的抵抗力较差，经力。该病毒具备特殊的囊膜结构，对有机溶剂比较敏感。其相06Da，在氯化铯中的浮密度为 1.14-1.6g/mL。病毒主要由反转膜糖蛋白组成。其中，核心蛋白主要是 p28，另外还有 p19、p则是以 gp135 为主。CAEV 主要感染单核细胞和巨噬细胞，并或睾丸等细胞上增殖[42]，山羊关节滑膜（Goat synovial membrEV 的分离和体外培养，是该病毒的指示细胞。将感染病羊的周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）与够分离得到 CAEV 毒株，并获得良好的病毒增长和繁殖。在

基因组结构,细胞病变效应,基因

的细胞内增殖，，出现典型的细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)。MVV 的指示细脉络丛细胞（SCP）。细胞病变效应向外扩展直至完全覆盖单层细胞培养物，同时随着多核巨细胞的大量生成，巨细胞中央核数目为 2-20 个，发生细胞变性。细胞物中的病变效应一般出现在接种后的 14-21 天，但病毒在通过数次传代培养、大量的情况下，能够在 3-15 天产生细胞病变效应。这种细胞病变效应不仅能够产生于的对应细胞培养物中，还能产生于其他的某些细胞培养物中，比如小鼠、大鼠和仓传代细胞培养物内；人、犬、猪、牛的脉络丛原代细胞；猪源、牛源的脉络丛传代。这些经过接连侵染的细胞产物会出现转化的明显特点，即丧失了接触抑制，生长加快[117]。.2 分子生物学特征.2.1 CAEV 的基因组CAEV 的完整基因组大小为 9.2kb，由两条单股正链 RNA 构成。基因组从 5’端到依次为 5’-LTR-gag-pol-env-LTR-3’[44]。其中，除编码结构蛋白的 gag 基因、pol 基因v 基因，CAEV 还具有编码调节蛋白的 tat 基因和 rev 基因，编码辅助蛋白的 vif 基病毒的感染及复制过程中，这些基因所编码的调节蛋白和辅助蛋白是不可或缺的存]。CAEV 完整的基因组结构见图 2。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65

【参考文献】